生化实验三果蔬中蛋白质含量测定.pptx

生物化学实验生物化学实验生物化学实验生物化学实验第一部分第一部分第一部分第一部分果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析综合实验一：果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析实验一实验一 果蔬中维生素果蔬中维生素C的定量测定（的定量测定（4学时）学时）实验二实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）学时）实验三实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（果蔬中蛋白质含量的测定（4学时）学时）实验四实验四 果蔬中过氧化物酶分析（果蔬中过氧化物酶分析（12学时）学时）实验材料：实验材料：冬枣柚子冬枣柚子14组组梨（梨（2个品种）个品种）58组组盘菜萝卜盘菜萝卜 912组组实实 验验 三三果蔬中蛋白质含量的测定果蔬中蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）（考马斯亮蓝法）一、目的一、目的 1、掌握蛋白质测定的方法和技术。、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理二、原理 考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250在在酸酸性性游游离离状状态态下下呈呈棕棕红红色色，最最大大光光吸吸收收在在465nm，当当它它与与蛋蛋白白质质结结合合后后变变为为蓝蓝色，最大光吸收在色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合染料复合物在波长为物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。白质的量。三、实验器材三、实验器材1、可见光分光光度计、可见光分光光度计2、旋涡混合器、旋涡混合器3、试管、试管16支支四、实验试剂四、实验试剂1、标准蛋白质溶液、标准蛋白质溶液牛血清清蛋白牛血清清蛋白(bsa)：配制成配制成1.0mg/mL和和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。的标准蛋白质溶液。2、考马斯亮兰、考马斯亮兰G-250染料试剂：染料试剂：称称100mg考考马马斯斯亮亮兰兰G-250，溶溶于于50mL 95%的的乙乙醇醇后，再加入后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀释至的磷酸，用水稀释至1L。3、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH6.8）4、各种果蔬、各种果蔬五、操作五、操作1、标准曲线绘制：、标准曲线绘制：取取6支试管，按下表加入各试剂。支试管，按下表加入各试剂。管号管号试剂试剂 012345100 g/mL牛血清白蛋牛血清白蛋白溶液白溶液mL 0 0.20.40.60.81.0蒸馏水蒸馏水mL 1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液考马斯亮蓝液mL 5.05.05.05.05.05.0 加加入入考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250蛋蛋白白试试剂剂后后，摇摇匀匀，放放置置2min后后，在在595nm波波长长下下比比色色测测定定，记录记录A595。以以各各管管相相应应标标准准蛋蛋白白质质含含量量（g）为为横横坐标、坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备样品制备：称称取取1g待待测测植植物物鲜鲜样样置置于于冰冰浴浴上上的的研研钵钵内内，加加 入入 1mL H2O或或 0.05mol/L Tris-HCl缓缓 冲冲 液液（pH6.8）研研成成匀匀浆浆，转转入入离离心心管管，再再用用2mL水水或或缓缓冲冲液液将将附附着着在在研研钵钵壁壁上上的的研研磨磨样样品品洗洗下下并并全全部部转转入入离离心心管管，3500rpm离离心心1520min，其其上上清清液液即为蛋白质提取液，供分析用。即为蛋白质提取液，供分析用。（注：盘菜，萝卜稀释至（注：盘菜，萝卜稀释至10mL）3、样品测定样品测定：试试管管中中加加自自制制蛋蛋白白质质样样品品1.0mL，再再加加入入5.0mL考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250试试剂剂，摇摇匀匀，放放置置5min后后，在在595nm波长下比色，记录波长下比色，记录A595。根据所测根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。从标准曲线上查得蛋白质含量。注意事项：注意事项：、如如果果测测定定要要求求很很严严格格，可可以以在在试试剂剂加加入入后后的的520min内内测测定定光光吸吸收收，因因为为在在这这段段时时间间内内颜颜色色是是最稳定的。比色反应需在最稳定的。比色反应需在1h内完成。内完成。、测测定定中中，蛋蛋白白-染染料料复复合合物物会会有有少少部部分分吸吸附附于于比比色色杯杯壁壁上上，实实验验证证明明此此复复合合物物的的吸吸附附量量是是可可以以忽忽略略的的。不不可可使使用用石石英英比比色色皿皿（因因不不易易洗洗去去染染色色），可可用用塑塑料料或或玻玻璃璃比比色色皿皿，测测定定完完后后可可用用95%的的乙乙醇醇将蓝色的比色杯洗干净。将蓝色的比色杯洗干净。实实 验验 三三果蔬中蛋白质含量的测定果蔬中蛋白质含量的测定（Folin-酚试剂法酚试剂法）一、目的一、目的 1、掌握蛋白质测定的方法和技术。、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理二、原理 Folin-Folin-酚酚酚酚试试试试剂剂剂剂法法法法是是是是双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法的的的的发发发发展展展展。其其其其试试试试剂剂剂剂由由由由甲甲甲甲、乙乙乙乙两两两两部部部部分分分分组组组组成成成成。甲甲甲甲试试试试剂剂剂剂相相相相当当当当于于于于双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲试试试试剂剂剂剂，可可可可与与与与肽肽肽肽键键键键起起起起呈呈呈呈色色色色反反反反应应应应。乙乙乙乙试试试试剂剂剂剂（即即即即Folin-Folin-酚酚酚酚试试试试剂剂剂剂）在在在在碱碱碱碱性性性性条条条条件件件件下下下下极极极极不不不不稳稳稳稳定定定定，易易易易被被被被酚酚酚酚类类类类化化化化合合合合物物物物还还还还原原原原而而而而呈呈呈呈蓝蓝蓝蓝色色色色（钼钼钼钼蓝蓝蓝蓝和和和和钨钨钨钨兰兰兰兰的的的的混混混混合合合合物物物物），其其其其颜颜颜颜色色色色深深深深浅浅浅浅与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的含含含含量量量量成成成成正正正正比比比比，因因因因此此此此通通通通过过过过比比比比色色色色可可可可测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质的浓度质的浓度质的浓度质的浓度。本本方方法法最最大大的的优优点点是是灵灵敏敏度度高高，比比双双缩缩脲脲法法灵敏灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏倍，较紫外分光光度法灵敏1020倍。倍。三、实验器材三、实验器材1、分光光度计、分光光度计2、电热恒温水浴箱、电热恒温水浴箱3、试管、试管 15150mm4、刻度吸管、刻度吸管 0.5mL、1mL、5mL5、试管架、试管架6、容量瓶、容量瓶 500mL7、坐标纸、坐标纸四、实验试剂四、实验试剂1、甲试剂：、甲试剂：2g无无水水碳碳酸酸钠钠，加加入入0.1mol/L氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液100mL混匀；混匀；：称称取取CuSO45H2O 0.5g，加加入入1%（35mmol/L）酒石酸钾钠溶液）酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。，混匀。使使用用前前将将与与按按50:1混混合合即即成成碱碱性性硫硫酸酸铜铜溶溶液液。（混混合合后后，试试剂剂只只能能使使用用一一天天，但但碱碱性性溶溶液液和和0.5%CuSO45H2O溶液可分别长期保存）溶液可分别长期保存）2、乙试剂：、乙试剂：在在2L磨磨口口回回流流装装置置中中加加入入100g钨钨酸酸钠钠，25g钼钼酸酸钠钠及及700mL蒸蒸馏馏水水，再再加加入入50mL 85%磷磷酸酸及及100mL浓浓HCl，充充分分混混合合后后用用小小火火回回流流10小小时时。回回流流完完毕毕冷冷却却后后，加加入入150g锂锂，50mL蒸蒸馏馏水水及及液液体体溴溴数数滴滴，摇摇匀匀后后再再开开口口沸沸腾腾15分分钟钟，以以驱驱逐逐过过量量溴溴。溶溶液液冷冷却却后后稀稀释释至至1000mL，溶溶液液呈呈透透明明淡淡黄黄色色，置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。使使用用前前用用标标准准NaOH溶溶液液标标定定，以以酚酚酞酞为为指指示示剂剂，标标定定其其酸酸度度为为1 mol/L，此此为为乙乙试试剂剂应应用用液液，置置冰箱中可长期保存。冰箱中可长期保存。3、牛血清白蛋白标准液（、牛血清白蛋白标准液（200 g g/mL）：）：准准确确称称取取牛牛血血清清白白蛋蛋白白粉粉末末50.0mg，用用0.1 mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到溶液润湿溶解，加蒸馏水到250mL。4、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH6.8）5、各种果蔬、各种果蔬 五、操作五、操作1、标准曲线绘制：、标准曲线绘制：取取7支试管，按下表加入各试剂。支试管，按下表加入各试剂。试剂试剂0123456牛血清牛血清白蛋白白蛋白标准液标准液0.0mL 0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸馏水蒸馏水1.0mL 0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲试剂甲试剂5.0mL 5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混匀，于混匀，于2025（或室温下）放置（或室温下）放置10min乙试剂乙试剂0.5mL 0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL 迅迅速速混混匀匀，2025（或或室室温温下下）放放置置30min，用用分分光光光光度度计计，在在波波长长500nm下下，以以“0”号管调零，测定各管吸光度。号管调零，测定各管吸光度。以以各各管管吸吸光光度度为为纵纵坐坐标标，各各标标准准蛋蛋白白浓浓度为横坐标，绘制标准曲线。度为横坐标，绘制标准曲线。2、样品制备样品制备：称称取取1g待待测测植植物物鲜鲜样样置置于于冰冰浴浴上上的的研研钵钵内内，加加 入入 1mL H2O或或 0.05mol/L Tris-HCl缓缓 冲冲 液液（pH6.8）研研成成匀匀浆浆，转转入入离离心心管管，再再用用2mL水水或或缓缓冲冲液液将将附附着着在在研研钵钵壁壁上上的的研研磨磨样样品品洗洗下下并并全全部部转转入入离离心心管管，3500rpm离离心心1520min，其其上上清清液液即为蛋白质提取液，供分析用。即为蛋白质提取液，供分析用。（注：盘菜，萝卜稀释至（注：盘菜，萝卜稀释至10mL）3、样品测定样品测定：取取2只试管编号，按下表加入试剂：只试管编号，按下表加入试剂：试剂试剂空白管空白管测定管测定管蛋白质提取液蛋白质提取液-1.0mL蒸馏水蒸馏水1.0mL-甲试剂甲试剂5.0mL5.0mL混匀，于混匀，于2025（或室温下）放置（或室温下）放置10min乙试剂乙试剂0.5mL0.5mL 迅迅速速混混匀匀，2025（或或室室温温下下）放放置置30min，用用分分光光光光度度计计，在在波波长长500nm下下，以以“0”号管调零，测定各管吸光度号管调零，测定各管吸光度六、结果处理六、结果处理 根根据据测测定定管管吸吸光光度度，在在标标准准曲曲线线上上查查出出对对应应的的标标准准蛋蛋白白质质的的浓浓度度，再再乘乘以以稀稀释释倍倍数数，即即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。注意事项：注意事项：1、Folin-酚酚试试剂剂在在酸酸性性条条件件下下较较稳稳定定，在在加加入入到到碱碱性性的的铜铜离离子子-蛋蛋白白质质溶溶液液中中时时（pH约约10），必必须须立立即即混混匀匀，以以便便在在磷磷钼钼酸酸、磷磷钨钨酸酸试试剂剂破破坏坏之之前前，即即发生还原反应。发生还原反应。2、本本法法受受多多种种因因素素干干扰扰，凡凡对对双双缩缩脲脲反反应应起起干干扰扰作作用用的的基基团团以以及及在在性性质质上上是是氨氨基基酸酸或或肽肽的的缓缓冲冲液液均均可干扰可干扰Folin-酚反应。酚反应。3、所所测测蛋蛋白白质质样样品品中中若若含含酚酚类类及及柠柠檬檬酸酸也也会会干干扰扰Folin-酚酚反反应应。在在测测试试时时应应排排除除干干扰扰因因素素或或作作空空白白试试验验。浓浓度度较较低低的的尿尿素素、胍胍、三三氯氯乙乙酸酸、乙乙醚醚等等（各各0.5%左左右右）、硫硫酸酸钠钠、硝硝酸酸钠钠（各各1%）、乙乙醇醇（5%）等等溶溶液液对对显显色色无无影影响响。但但含含量量高高时时，必必须须做做校校正正曲曲线线。含含硫硫酸酸铵铵的的溶溶液液只只需需加加浓浓碳碳酸酸钠钠-氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液即即可可。若若样样品品酸酸度度很很高高，显显色色后后色色浅浅，则则必必须须提提高高碳碳酸酸钠钠-氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液的的浓浓度度12倍倍。另外此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。另外此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。