高级别脑膜瘤中异常甲基化调控相关基因识别研究.pdf

2023 年10 月 第 44 卷 第 5 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Oct.2023Vol.44 No.5基金项目:北京市临床重点专科项目。This study was supported by Clinical Major Specialty Project of Beijing.Corresponding author,E-mail:liwenbin 网络出版时间:2023-10-20 1029 网络出版地址:https:/ 郑 义 李生兰 于建宇 兰燕杰 刘昕蕊 陈 峰 李文斌(首都医科大学附属北京天坛医院肿瘤中心神经肿瘤综合治疗病区,北京 100070)【摘要】目的 拟通过生物信息学进一步挖掘高级别脑膜瘤潜在的生物标志物及治疗靶点。方法 通过公共数据库大数据分析初步了解高级别脑膜瘤恶性程度高的原因,评估其基因组特性及异常甲基化调控的相关基因。结果 识别出表达受异常甲基化调控的基因共 3 006 个,其中突变频率较高的基因 210 个,挖掘出恶性肿瘤发展、迁移相关通路。结论 筛选出高级别脑膜瘤中潜在受异常甲基化调控的基因及相关通路,可作为高级别脑膜瘤的生物标志物及潜在的治疗靶点。【关键词】高级别脑膜瘤;异常甲基化;信号通路【中图分类号】R739.45 【文献标识码】AStudy of genes associated with aberrant methylation regulation in high-grade meningiomasPeng Yichen,Zheng Yi,Li Shenglan,Yu Jianyu,Lan Yanjie,Liu Xinrui,Chen Feng,Li Wenbin(Department of Neuro-oncology,Cancer Center,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100070,China)【Abstract】ObjectiveTo explore potential therapeutic targets with bioinformatics for the treatment of meningiomas,the most common primary central nervous system tumors.Methods A preliminary understanding of the genomic characteristics of high-grade meningiomas was obtained through analysis of public databases to assess the genes associated with aberrant methylation regulation.Results A total of 3 006 genes whose expression was regulated by aberrant methylation were identified,including 210 genes with high mutation frequency,and pathways associated with malignant tumor development and migration were mined.ConclusionsGenes and related pathways potentially regulated by aberrant methylation in high-grade meningioma provides bio-markers and potential therapeutic targets for high-grade meningioma.【Key words】high-grade meningioma;aberrant methylation;signaling pathway 脑膜瘤起源于硬脑膜内表面的蛛网膜细胞,是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占所有中枢神经系统肿瘤的 36%,非恶性中枢神经系统肿瘤的53%1-2。脑膜瘤的发病率随着年龄的增长而增加,从 019 岁的 0.14/100 000 明显增加到 7584 岁的37.75/100 0003。2021 年第 5 版世界卫生组织(World Health Organization,WHO)中枢神经系统肿瘤分类1,4根据病理特征将脑膜瘤分为三级,其中恶性程度最高的为级脑膜瘤,10 年总生存率为 0%。手术及放射治疗(以下简称放疗)是恶性脑膜瘤的主要治疗方法。无症状恶性脑膜瘤通常生长迅速,需尽快行手术切除以缓解占位效应,且术中切除范围与复发的概率密切相关,因此应最大范围内安全切除脑膜瘤病灶5。对于高级别脑膜瘤患者,术后应行放疗。放疗同样适用于有手术禁忌证的患者。脑膜瘤的放疗方案应是个体化的,取决于脑膜瘤体积的大小、与颅内重要功能区的距离及既往接受放疗的方案6。但由于治疗方案有限,大约 80%的高级别脑膜瘤在初次手术切除后会复发7。尽管在手术和放疗难治的脑膜瘤患者中已开展了一定数量的临床试验,但仍没有一种药物表现出明显的临床疗效,因此临床亟需新的有效治疗手段提高恶性脑膜瘤患者的预后。近年来,随着癌细胞基因组测序项目的实施和癌症研究的进展,表观遗传学在肿瘤发生中的作用已被广泛接受8。越来越多的研究9-10表明,癌症是多种因素的结果,表观遗传学修饰通过调控癌基因及抑癌基因,为肿瘤发生过程中 DNA 序列没有变化而与基因相关的表型变化提供了合理的解释。本研究通过公共数据库,发掘相对于低级别脑膜瘤,高级别脑首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷膜瘤的基因组特性及潜在受异常甲基化调控的基因及相关通路,进一步为找出高级别脑膜瘤的生物标志物及潜在的治疗方案提供思路。1 资料与方法1.1 数据来源使用 cBioPortal11来分析高级别脑膜瘤的基因组特征。cBioPortal 中的基因变化主要包括基因突变、深度缺失和扩增等。从 GEO 数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载甲基化数据集GSE178139 和 GSE42882。它们均来源于 GPL13534平台,即 Illumina Human Methylation450 BeadChip 芯片。GSE178139 包括个 11 个低级别脑膜瘤样本和 1个高级别脑膜瘤样本;GSE42882 包括 9 个低级别脑膜瘤样本和 10 个高级别脑膜瘤样本。1.2 数据处理使用 R 软件(version 4.2.2)对数据进行处理。首先通过“ChAMP”R 包进行数据的归一化及标准化,通过主成分分析(principal component analysis,PCA)图及相关性分析对样本进行筛选,最后选择 P0.2 作为筛选标准,得到差异甲基化基因(methylated-differentially expressed genes,DMGs)。最后,对于差异表达分析结果,使用 R 软件中的 Venn Diagram 包(v1.6.20)来识别重叠的 DMGs 和高频突变基因。1.3 功能和通路富集分析通过使用 R 语言中 clusterProfiler(v3.0.4)R包,对基因和基因的功能谱进行了分析和可视化。利用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)对基因的相关通路进行分析,选择 P0.05 作为筛选标准,并用 ggplot2 对top25 的通路进行可视化。应用 Metascape(https:/metascape.org/)对筛选出的基因绘制基因本体(gene ontology,GO)基因功能富集分析。2 结果2.1 高级别脑膜瘤的基因组特征通过 cBioportal 数据库对不同级别的脑膜瘤进行分析,结果显示,脑膜瘤中 NF2 是最常发生点突变的基因,且其发生率在不同级别脑膜瘤中差异较大。同时,CRBBP、TRAF7 等促进肿瘤增殖相关基因及NMT3A 等表观遗传学相关基因也发生突变,共同参与了脑膜瘤的发生发展。与良性脑膜瘤相比,级脑膜瘤 的 肿 瘤 突 变 负 荷(tumor mutational burden,TMB)较高(图 1A),提示级脑膜瘤的基因组较不稳定。对发生小片段序列插入或者删除及单核苷酸变异的频率分析结果显示,恶性脑膜瘤发生上述事件的概率显著高于良性脑膜瘤(图 1B),进一步提示级脑膜瘤的恶性程度高与其基因组不稳定性相关。在这些突变基因中,级脑膜瘤的突变类型多为错义突变,其次为沉默突变及移码突变,与、级脑膜瘤基因突变类型相似(图 1C)。2.2 构建高级别脑膜瘤的甲基化谱利用 GEO 数据库(GSE178139 和 GSE42882)进行差异甲基化基因分析。根据样本临床信息中的组织学分级,将样本分为高级别脑膜瘤及低级别脑膜瘤两组,并根据标准化后的表达情况进行筛选(图2A)。通过差异分析,共筛选出 DMGs 3 006 个,其中高甲基化的基因 1 139 个,低甲基化基因 1 876 个。对差异基因进行 KEGG 富集分析显示,DMGs 主要集中于 Rap1、MAPK 等细胞通路(图 2B),提示高级别脑膜瘤中细胞黏附及肿瘤发生相关细胞通路更容易被激活,提示其增殖能力更强。2.3 DMGs 的功能富集分析将 DMGs 与 cBioPortal 中高频突变的基因取交集,分析甲基化异常与基因组不稳定的关系,结果显示,共识别出 210 个可能与高级别脑膜瘤发生发展相关的基因(表 1),其中有 137 个低甲基化基因和 73个高甲基化基因,因此,高级别脑膜瘤中主要为低甲基化模式,提示其染色质活性较高。对上述基因进行GO 富集,评估甲基化异常基因的生物学功能显示,高级别脑膜瘤参与多个细胞生物过程,包括细胞增殖、免疫等。3 讨论脑膜瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。虽然大多数脑膜瘤是良性的,但仍有一小部分具有复发率高、组织结构多变、对标准治疗抵抗的特点,而这些高级别侵袭性脑膜瘤复发后往往预后很差12。2021 年 WHO 分类首次将分子特征,即 pTERT 突变和 CDKN2A/B 纳入脑膜瘤分级,以更好识别没有恶性组织学特征但易复发的脑膜瘤1。且随着对脑膜瘤分子机制方面的研究逐渐深入,靶向治疗逐渐成为潜在的新型治疗方案。例如 NF2 基因发生突变的患者中有 50%75%患脑膜瘤13,进一步导致了哺乳动847第 5 期彭怡琛等:高级别脑膜瘤中异常甲基化调控相关基因识别研究图 1 脑膜瘤的基因组特征Fig.1 Genomic features of meningiomasA:top 50 genes with mutation frequency and their mutation types in meningiomas;B:frequency of insertions or deletions and single nucleotide variants in meningiomas;C:types of mutations in meningiomas.图 2 富集分析Fig.2 Enrichment analysisA:PCA plot;B:KEGG pathway analysis of hypermethylated and hypomethylated genes;C:venn plot;D:the GO function analysis of hypermethylated and hypomethylated genes;PCA:principal component analysis;KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes;DMGs:methylated-differentially expressed genes;GO:gene ontology.947首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷表 1 差异甲基化基因Tab.1 DMGs Gene SymbolENTREZIDGene SymbolENTREZIDGene SymbolENTREZIDABCC510 057TBR110 716HMGB13 146ANAPC429 945TEX1456 155IGSF9B22 997AP2A2161TEX255 852IQCH64 799ASPG374 569TGM6343 641ITGB43 691ATN11 822TKT7 086KIF13B23 303BCL2L1598TMEM64169 200KIF1A 547C1orf87127 795TRAPPC983 696KIFC33 801CAMK2B816UNC13A23 025KIRREL384 623CEP3509 857UPB151 733KLF49 314CHST1551 363USH2A7 399LAMB422 798CLDN25644 672USP77 874LDB311 155COL1A11 277XPNPEP17 511LHFPL210 184COL4A21 284ZNF827152 485LHFPL5222 662CUX11 523ABCA13154 664LMBR164 327DCHS18 642ABCC1185 320LMO24 005DNAJC1485 406ACACB32LMO74 008ENPP7339 221ACTN288LPGAT19 926EPHX379 852AHNAK79 026LTV184 946ERC226 059AKIRIN179 647MAP4K111 184EXOC255 770ALDH3A1218MCTP179 772FBXL225 827AMBRA155 626MFAP3L9 848FERMT383 706ANK3288MMP2656 547FMN1342 184ANKRD31256 006MRPL1328 998FUCA12 517ANO155 107MTPAP55 149GADL1339 896APOH350MTR4 548GRID22 895ATP13A379 572MYH1522 989GRK52 869AURKA6 790NAP1L14 673HDAC751 564AVIL10 677NBEAL165 065HEPHL1341 208BMPER168 667NFATC14 772HPS384 343C10orf55414 236NOTCH14 851HS6ST3266 722CCDC150284 992NOX350 508HTR73 363CCDC6880 323NPY1R4 886INO8054 617CHD21 106OR2AK2391 191ITGB13 688CLRN3119 467PCDH95 101KCNG493 107CMYA5202 333PDZD223 037KCNJ163 773CNTNAP226 047PIGO84 720LYPD327 076COX101 352PRDM693 166MAML355 534CRISP27 180PREX157 580MAP3K114 296CSDE17 812PTPRZ15 803MATN34 148CTNNA21 496RELN5 649MED13L23 389CUX223 316RIMS122 999MGAT4A11 320DAAM123 002RTN16 252MMP154 324DGKD8 527SCRIB23 513MYOM29 172DLEC19 940SERPING1 710NAGLU4 669DNAH91 770SIDT154 847NCOA48 031DNMT3A1 788SLC12A710 723NOTCH34 854DOCK1055 619SLC7A823 428NRXN19 378DSCAM1 826SNTB16 641NRXN29 379DST667SORCS1114 815OBSCN84 033DYNC1H11 778SPATA5166 378OSBPL5114 879ECT2L345 930SPOP8 405PCDHA156 147EFNB2 1 948SRRM223 524PHC380 012ELF21 998SYNE223 224PHF1257 649EMP22 013TAF383 860PLXNA25 362ENTHD1150 350TEK7 010057第 5 期彭怡琛等:高级别脑膜瘤中异常甲基化调控相关基因识别研究续表 1Gene SymbolENTREZIDGene SymbolENTREZIDGene SymbolENTREZIDPNPLA1285 848EPB41L22 037TMEM13123 505PON35 446EWSR12 130TMEM132D121 256PPP1R12A4 659EXTL32 137TOPBP111 073RASGRP325 780FAT12 195TRAF784 231RASSF29 770FAT479 633TRERF155 809RNF21357 674FBXW1123 291TRIM248 805SEMA7A8 482FGD655 785TTLL11158 135SHANK150 944FRAS180 144USP4755 031SHMT26 472FREM2341 640USP54159 195SIGLEC6946FRYL285 527VPS13B157 680SMC1B27 127FZD57 855WDR72256 764SMOC264 094GLUL2 752ZFHX3 463ST3GAL16 482HBP126 959ZNF29223 036STAT46 775HHAT55 733ZNF385B151 126SYPL16 856HK13 098ZNF470388 566 DMGs:methylated-differentially expressed genes.物雷帕霉素复合物 1(mammalian target of rapamycin 1,mTORC1)的过度表达,mTOR 抑制剂依维莫司与奥曲肽联合治疗脑膜瘤可有效延长 1 年总生存率(o-verall survival,OS)至 75%,且约 80%患者的肿瘤增长率下降了 50%以上14。然而,由于这些基因突变在复发的脑膜瘤中相对罕见,此方法仍然不能很好预测高级别脑膜瘤的复发。近年来,一些研究15表明,可以通过整合 DNA甲基化分析、转录组学和基因测序对临床结果做出更好的预测。DNA 甲基化相比基因突变而言具有癌症亚型的特异性和相对频繁且稳定等优点16,已被广泛用作肿瘤早期诊断的生物标志物17。DNA 甲基化大多发生于鸟嘌呤核苷酸 5 的胞嘧啶上,被称为CpG 岛(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)18。生理条件下,DNA 甲基化可通过协调人类细胞类型表型多样性的产生和维持,在发育过程中发挥重要作用19。但异常甲基化相关基因会导致免疫失调和恶性肿瘤的发生,其对脑膜瘤恶性程度的影响仍亟需深入研究。本文通过分析高级别脑膜瘤与低级别脑膜瘤在基因组特性及异常甲基化基因方面的差异,发现高级别脑膜瘤有更不稳定的基因组,进一步提示可能与其恶性程度较高相关;且识别出高级别脑膜瘤中潜在受异常甲基化调控的基因及相关通路,可作为高级别脑膜瘤的生物标志物及潜在的治疗靶点。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献声明彭怡琛:研究命题的提出、设计,数据分析,论文撰写;郑义、于建宇:获取公共数据;李生兰、兰燕杰:协助进行数据分析;刘昕蕊:文章润色;陈峰:修正命题思路;李文斌:论文总体把关、审定。参考文献 1 Louis D N Perry A Wesseling P et al.The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system a summary J.Neuro Oncol 2021 23 8 1231-1251.2 Ostrom Q T Gittleman H Fulop J et al.CBTRUS statistical report primary brain and central nervous sys-tem tumors diagnosed in the United States in 2008-2012 J.Neuro Oncol 2015 17 Suppl 4 1-62.3 Ostrom Q T Gittleman H Xu J et al.CBTRUS sta-tistical report primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2009-2013 J.Neuro Oncol 2016 18 suppl_5 v1-v75.4 Maggio I Franceschi E Tosoni A et al.Meningio-ma not always a 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