干扰TAK1通过下调TAB2_3来抑制肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化.pdf

干扰 通过下调/来抑制肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化章艳菊 周小娣 夏云飞 【摘要】目的 探讨转化生长因子 激活激酶()对转化生长因子()诱导的人胚肺成纤维细胞()的增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响及其与 结合蛋白()/的关系 方法 将细胞分组分为 组(未处理)、组(/诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)采用 和 检测 和/的表达 检测细胞增殖 和细胞划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力 检测迁移和纤维化相关蛋白的表达 免疫共沉淀验证 和/之间的关联 结果 与 组比 诱导后 及/表达升高(均 )组与 组相比其增殖、侵袭、迁移能力明显下降迁移及纤维化相关蛋白表达明显下降(均 )/组与 组比增殖、侵袭、迁移能力上升迁移及纤维化相关蛋白表达上升()结论干扰 通过下调/来抑制 诱导的肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化【关键词】转化生长因子 激活激酶 结合蛋白/肺纤维化侵袭迁移 /.【】()()()()/.()(/)()().()()()./()./.().()./().()./.【】/:./.作者单位:江苏 南通南通大学附属医院.感染管理办公室.风湿免疫科通信作者:夏云飞:.临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期 肺纤维化()不仅是一种疾病而且是其他多种慢性肺部疾病的终末期病理改变 是多种慢性肺部疾病致残和死亡的主要原因 是一种不可逆的间质性疾病特别是特发性纤维化患者的平均生存时间只有 年因此 的发生发展机制及治疗方案正在被不断深入研究中 激活激酶()是丝裂原活化蛋白激酶()家族的一个成员 它在免疫反应、炎症反应和纤维化等疾病中起着重要的作用 作为 信号通路的关键上游因子可被转化生长因子()、样受体等因子激活 在成年小鼠肾组织中 可激活的、和 促进肾间质肌成纤维细胞的积累和胶原沉积 在尘肺患者和硅暴露大鼠的肺组织以及大鼠的肺泡巨噬细胞中过表达可加重肺部炎症和纤维化 然而据我们所知 在 中的作用尚未被研究通过检索蛋白质相互作用分析数据库 和通用生物学互作资源数据库 发现 与 结合蛋白()/共表达并可以与/结合 患者中/的表达增加 因此我们推测 可以调控/促进 的进展 因此本研究中主要讨论 在 诱导的肺成纤维细胞增殖、侵袭、迁移和纤维化中的作用并探讨了其机制以期为 治疗提供新的靶点资料与方法一、实验材料与方法细胞培养、分组及转染:人胚肺成纤维细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)在()中添加 胎牛血清()进行培养培养条件:湿度饱和 分组:组(未进行任何处理)、组(/诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)、组(转染 诱导)组用 /()处理细胞 使用 试剂将、转染至 后用 /处理细胞后进行后续实验 羟脯氨酸含量()测定:根据检测试剂盒()说明通过测定羟脯氨酸来评估培养细胞中的胶原蛋白含量数据库:数据库(.)和 数据库()检测 和/之间的关系:使用 试剂盒(赛默飞世尔科技公司)检测蛋白质浓度 根据所测蛋白浓度每孔吸取 蛋白装载到 的 凝胶上 凝胶电泳后将蛋白转移到 膜上然后用 牛血清白蛋白在室温下封闭 然后用一抗在 下孵育过夜 使用的一抗如下:平滑肌肌动蛋白()()基质金属蛋白酶 ()基质金属蛋白酶()纤维连接蛋白 ()型胶原蛋白()型胶原蛋白()()()和()在与二抗()孵育 发光扫描图像 分析条带灰度值逆转录 定量():根据说明书使用 试剂盒(赛默飞世尔科技公司)从 细胞中获得总 合成使用 第一链合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司)根据一步法 试剂盒()(赛默飞世尔科技公司)进行 扩增 所使用的热循环条件为:后 循环 次 相对基因表达量采用 方法 以 作为内参基因 用于序列检测的特异性引物如下:正向:反向:正向:反向:正 向:临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期 反 向:正向:反向:():使用 试剂盒()测定细胞增殖活性 将细胞以 个/孔的密度接种到 孔板中在 条件下过夜生长 然后转染(如上所述)用 处理然后加入 的 溶液 然后将细胞孵育 小时使用酶标仪在 波长处测定吸光度()细胞划痕实验:细胞在 孔板中培养直到它们在含有胎牛血清 中融合达到 使用移液枪头尖端在单层细胞进行划痕 用 洗涤细胞 次并在含无血清培养基的培养箱中培养 和 时使用光学显微镜获得连续图像 通过测量细胞的迁移距反映细胞的迁移能力 实验:细胞用无血清培养基处理 重悬细胞 计数后调整细胞密度至 /小室放置 孔板()中将细胞悬液()加 入上室下室加入 含有 胎牛血清的 培养 取出 小室弃去培养液用棉签去除上层未通过膜的细胞后加入 多聚甲醛在室温下固定细胞 将膜底部的细胞用结晶紫染料在室温下染色在显微镜下计数侵袭的细胞 免疫共沉淀():使用 免疫共沉淀试剂盒()细胞裂解液中加入抗体经过洗脱收集免疫复合物然后进行 及 分析 以抗 抗体作为阴性对照 和 抗体作为一抗山羊抗兔(北京康为世纪生物科技有限公司)作为二抗进行免疫印迹分析二、统计分析采用 软件进行数据分析计量资料以 表示两组间比较采用独立样本 检验多组间比较采用单因素方差分析的方法多组间两两比较采用 检验的方法 被认为差异有统计学意义结 果一、抑制 表达对 细胞增殖的影响 诱导 后细胞增殖逐渐转化为扁平状纤维结构的肌成纤维细胞 与 组比较 组 和 蛋白表达水平均明显增加()(图)并通过 检测到胶原蛋白含量增加(图)细胞模型诱导成功 与 组比 组的 表达增加(图)在未经处理的 中转染 与 组相比在 和 组中 的表达显著下降 组更明显 与 组比 组中 的表达降低且 组的表达降低更明显()(图)后续的实验采用 结果显示与 组比较 组明显增殖与 组比 组增殖下降()(图)图 、和 表达水平:和 蛋 白 表 达:含 量 与 组比:图 的表达:表达:蛋白表达 与 组比:临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期图 对 细胞增殖的影响:各组 表达 各组 蛋白表达:细胞增殖检测 与 组比:与 组比:二、抑制 表达对 细胞的侵袭、迁移和纤维化的影响 和细胞划痕实验显示与 组比 组细胞的侵袭和迁移明显增加与 组相比 组的细胞侵袭和迁移显著减弱(图 )与 组比 组迁移相关蛋白()和纤维化相关蛋白()的表达增加与 组相比 组迁移和纤维化相关蛋白的表达下降(均 )(图 )结果表明 抑制 诱导 细胞的侵袭、迁移和纤维化 三、干扰 对/表达的影响利用 和 数据库发现 与/共表达(图)与 组相比 组中/的表达明显增加()(图 )结果显示 可以在 细胞中与/结合 与 组比 组/表达明显降低()(图)结果表明 可以抑制/的表达 四、过表达/对 细胞增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响在未经处理的 中转染 /即过表达/后/的表达显著增加与 组比 /组/表达显著增加()(图)与 组比 /组增殖、侵袭、迁移、迁移相关蛋白(、)和纤维相关蛋白(、和)明显增加(均 )(图)结果表明过表达/可以逆转 对 细胞增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响讨 论 的主要病理特征之一是过度增殖和肺成纤维细胞转化 是诱导 形成的关键细胞因子之一 它可以启动肺成纤维细胞的激活并调节它们的增殖、迁移和分化 多项研究表明肺纤维化过程中 水平升高 可促进肺成纤维细胞的增殖、侵袭和迁移合成胶原促进胶原在肺组织中的沉积 因此本研究采用 诱导 细胞显著增加了其增殖、侵袭和迁移显著增加了 和 的表达水平并通过 检测到胶原蛋白含量增加 结果表明细胞模型构建成功 与体内的炎症和应激有关其在不同的人体组织中的表达也不同 与人体正常的胚胎发育和神经系统修复有关 抑制 可以减少实验性尘肺的炎症和纤维化 小鼠纤维化上皮细胞中 和 基因增强子同源物 的缺失或者阻断核内肌动蛋白可减弱纤维化级联反应并恢复呼吸稳态 这些结果表明抑制 中 的表达与 的发生有关 此外有研究表明 可以被 等细胞因子激活 我临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期图 对 细胞侵袭、迁移和纤维化影响:迁移能力检测():细胞迁移率:侵袭能力检测(结晶紫染色):细胞侵袭率:迁移相关蛋白表达:纤维化相关蛋白表达 与 组比较 与 组比较 们的实验表明在用 诱导 细胞后细胞中 的表达明显增加 干扰细胞中 的表达后细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化均明显降低/已被证实在 和上游 受体相关因子之间起重要作用 此外/还被证实在引导 依赖的 激酶激活中发挥作用 利用 和 数据库还发现 与/共表达 可以调控/的表达 此外还验证了 与/的结合在 患者中/的表达已被证明增加并参与了 的过程 本研究证实了在 诱导的 细胞中/的表达显著增加 在 模型中 的表达增加 导致 表达的激活 本研究发现过表达/显著减弱了 干扰在 诱导的 细胞中的保护作用提示 可能通过调控/在 中发挥其作用 此外我们还发现转染 后临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期图 对/表达影响:和/关联图:/的 和蛋白表达:后/蛋白表达 与 组比较 图 过表达/对 细胞增殖影响:各组/表达:细胞增殖检测 与 组比较 与 组比较 与 比较 也增加了 可能的原因是 和 是两个同源的 多聚泛素结合的 衔接蛋白可能在脊椎动物进化的早期共享一个共同的祖先基因 这两个同源的衔接蛋白对于 的激活至关重要 然而具体的机制将在未来的实验中进一步探索综上所述本研究结果显示干扰 可能通过下调/在 诱导的成纤维细胞中发挥其保护作用 过表达/可以逆转 干扰对 细胞增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响这些发现为靶向治疗 提供了坚实的理论基础但是目前通过何种信号通路且缺乏体内研究这些都是我们需要继续研究的方向临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期图 过表达/对 细胞侵袭、迁移和纤维化影响:细胞迁移检测():细胞侵袭检测(结晶紫染色 ):细胞迁移率:细胞侵袭率:迁移相关蛋白表达:纤维化相关蛋白表达 与 组比较 与 组:与 比较 临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期参考文献 .:.():.():.:./.():.():.:.()():.():.():.():.:.:/.():.:.():.():.:.():.().():./.:.():.():.():.():.():./.():.():./.():.():.():.():.收稿日期:临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期