高效液相色谱⁃串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素.pdf

年 月 研究论文：收稿日期：通讯联系人：基金项目：福建省科技厅社会发展引导性（重点）项目（）：（）高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素刘磊琦，陈镜泽，傅武胜，唐翠英，（福建医科大学公共卫生学院，福建 福州；福建省人兽共患病研究重点实验室，福建省疾病预防控制中心，福建 福州；福建中医药大学药学院，福建福州；福建农林大学食品科学学院，福建 福州）摘要：蘑菇毒素种类繁多，化学结构差异大，为了实现蘑菇中毒素的准确、高通量分析，本文采用固相萃取净化技术，以高效液相色谱串联质谱法（）为分析手段，建立了蘑菇中 种鹅膏肽类、种色胺类蘑菇毒素的分析方法。优化了色谱条件、质谱参数和样品提取净化方法，蘑菇干粉以含 甲酸的甲醇提取，强阳离子交换柱（）净化后，待测样液用 色谱柱分离，以含 甲酸的 乙酸铵水溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测模式（）扫描，以基质匹配标准曲线法对鹅膏肽毒素定量，以同位素内标法对色胺类毒素定量。结果显示，种毒素在一定的浓度范围内与峰面积（或峰面积比）均呈良好的线性关系（）。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素、鹅膏肽类毒素的检出限（）分别为 、，定量限（）分别为 、；以香菇干粉为基质，在 个水平下加标，种鹅膏肽类毒素的回收率为 ，相对标准偏差（）为 ；种色胺类毒素的回收率为 ，为 ；与国家市场监管总局食品补充检验方法 进行比对，结果表明鹅膏毒素含量具有可比性，无显著性差异（）。该方法简便、快速，准确度和精密度较高，符合要求，适用于野生蘑菇中 种蘑菇毒素的检测。采用该法开展了福建省野生蘑菇中蘑菇毒素分布情况的调查，在全省 个设区市采集了 份野生蘑菇样品，采用核糖体 内转录间隔区（）分子条形码技术进行了种属鉴定，在 份样品中检测出了蘑菇毒素，在 份拟灰花纹鹅膏（）干粉提取物中检出 鹅膏毒肽、鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽，含量分别为、；在 份口蘑科（）蘑菇中检出脱磷裸盖菇素，含量为 。关键词：高效液相色谱串联质谱法；鹅膏毒肽；鬼笔毒肽；脱磷裸盖菇素；蟾蜍色胺；蘑菇中图分类号：文献标识码：，（，；，；，；，）：；，第 期刘磊琦，等：高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素 ，引用本文：刘磊琦，陈镜泽，傅武胜，唐翠英 高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素 色谱，（）：，（）：，（）（）（），（）（，）（），（）（），（），（），（），（），（），色谱第 卷，：（）；世界上有 多种大型野生真菌，其中 余种为有毒蘑菇；我国野生真菌有 多种，其中 多种为有毒蘑菇。蘑菇富含多糖且脂肪含量低，是世界卫生组织（）和联合国粮食及农业组织（）推荐的“超级食品”，但可食用蘑菇和有毒蘑菇外形上极易混淆，我国野生蘑菇中毒事件频发，多年来毒蘑菇一直是引起我国食源性中毒死亡的主要致病因子。根据结构和中毒机理，蘑菇毒素可分为鹅膏肽类、毒蝇碱、色胺类、异恶唑衍生物、鹿花菌素、鬼伞素及奥来毒素 类，已确定的毒性较强及比较常见的蘑菇毒素主要有鹅膏肽类及色胺类等。其中鹅膏肽类包括鹅膏毒肽（）和鬼笔毒肽（）等，色胺类包含脱磷裸盖菇素（）和蟾蜍色胺（）等，都是常见的神经精神型蘑菇毒素，脱磷裸盖菇素于 年从墨西哥裸盖菇（）中 分 离 得 到，分 布 在 花 斑 褶 伞 菇（）等 多种蘑菇中，是国家管制的精神类药品和致幻剂，易被用作毒品，食用后会出现视幻觉、狂笑、过度兴奋等。蟾蜍色胺是蛤蟆菌（）中的主要致幻成分，能引起色彩幻觉，在美国、英国和澳大利亚被归为违禁物质，在人体内不易被分解，即使排泄后仍有致幻作用。关于鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的研究已有不少报道，检测方法也较为成熟，国家市场监管总局发布了食品补充检验方法 ，该法采用亲水亲脂固相萃取柱（）结合 测定蘑菇中 种鹅膏肽类毒素，具体为 鹅膏毒肽（）、鹅 膏 毒 肽（）、鹅 膏 毒 肽（）、羧基二羟鬼笔毒肽（）、羧基三羟鬼笔毒肽（）、二羟鬼笔毒肽（），种鹅膏肽类的检出限（）、定量限（）分别为、。关于色胺类毒素检测的研究报道较少，等采用混合型阳离子交换柱（）结合 建立了生物样品（血清、血浆和尿液）中脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺的测定方法，为 ；等建立了聚合型强阳离子交换柱（）结合液相色谱高分辨质谱法（）检测尿液中鹅膏肽类（鹅膏毒肽、鹅膏毒肽）、色胺类毒素（脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺）和神经精神型蘑菇毒素（鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、毒蝇碱）的方法，鹅膏毒肽、色胺类的 分别为、。徐小民等建立了蘑菇中 种鹅膏肽类和 种神经精神型蘑菇毒素（鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、毒蝇碱和裸盖菇素）的测定方法，样品经提取、稀释后用 测定，较高，为 ，该方法适合野生菌中蘑菇毒素的检测。色胺类蘑菇毒素在酸性条件下容易形成阳离子化合物，鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换和非极性双重作用的固相萃取柱作为净化填料，本研究通过强阳离子固相萃取净化技术结合 ，建立了同时测定蘑菇中 种鹅膏肽类和 种色胺类毒素的检测技术，获得了更低的检出限，这将为蘑菇中毒事件的快速诊断和及时治疗提供技术支持。实验部分 仪器、试剂与材料 液相色谱串联质谱仪（日本岛津公司）；冷冻高速离心机（，长沙湘智离心机仪器有限公司）；漩涡混合器（美国 公司）；型和 型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；氮吹仪（上海安谱公司）；旋转蒸发仪（日本 公司）。柱（强阳离子交换型，美国 公司）。乙酸铵和甲酸（）（色谱纯，公司）、甲酸（优级纯，德国 公司）、氨水（优级纯，国药集团，纯度 ）、乙腈（色谱纯，美国 公司）、甲醇（色谱纯，德国 公司）、抗坏血酸（，天津光复精细化工研究所，纯度）。鹅膏毒肽、鹅膏毒肽、鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽，均来自美国 公司，纯度均；蟾蜍色胺（天津阿尔塔公司）和脱磷裸盖菇素（加拿大 公司），纯度均 第 期刘磊琦，等：高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素。同位素内标标准储备溶液脱磷裸盖菇素（）、蟾蜍色胺（）均购自加拿大 公司；香菇干粉由购自当地超市的鲜香菇样品烘干后粉碎而得。标准溶液的配制 毒素混合标准使用液：称取 种蘑菇毒素标准品粉末，分别用甲醇溶解后定容于 容量瓶中，得到质量浓度均为 的标准储备液；准确移取 种标准储备液，用甲醇定容，配制成 混合标准中间溶液；再准确移取 混合标准中间溶液，用甲醇稀释、定容，配制成 的混合标准使用液。内标混合标准使用液：取适量 种内标标准储备溶液，用甲醇配制成 。表 种蘑菇毒素、同位素内标的质谱参数及保留时间 （）（）（）（）（）（）（）：；：；：样品前处理 称取 （精确至 ）蘑菇干粉于 离心管中，准确加入 内标混合标准使用液，再加入 甲酸（优级纯）甲醇溶液，涡旋混匀，在 下超声提取 ，以 的转速离心 ，再重复提取一次，合并提取液，添加 （质量分数，下同）抗坏血酸溶液 后，提取液于 下减压蒸馏至近干，用 甲酸水溶液（含 抗坏血酸）洗涤鸡心瓶内壁。将溶液转入用 乙腈、甲酸水溶液活化平衡好的 柱中，分别用 甲酸水溶液、甲酸水溶液淋洗，然后用 氨水甲醇（，）洗脱，于 下氮吹至近干；准确加入 抗坏血酸溶液复溶，混匀后，以 转速离心 ，取上清液测定。仪器条件 液相色谱条件 柱（，美国 公司）；柱温：；流动相：乙酸铵水溶液（含 甲酸（色谱纯）；流动相：乙腈；梯度洗脱程序：，；，；，；，；，；，。流速：；进样量：。质谱条件电喷雾离子源正离子模式监测（）；雾化气、干燥气和加热气分别为氮气、氮气和空气，流量分别为 、和 ；碰撞气：氩气；脱溶剂管、接口和加热块温度分别为、和 ；种蘑菇毒素及其内标的监测离子对及质谱参数见表。统计分析 实验数据以“平均值标准差”表示，采用 整理数据，进行实验数据分析。各指标数据均进行正态性检验和方差齐性检验，两组间比较采用双侧检验，检验水准 设定为 ，当 表示差异有统计学意义。当数据满足方差齐性，进行 检验；数据不满足方差齐性时，进行非参数检验。色谱第 卷 结果与讨论 质谱条件的优化 种鹅膏肽类毒素均含有羟基、氨基和羰基等易于电离并产生正离子的官能团，因此可用 或的一种模式测定。优化过程中，种毒素在模式下的信号均高于，的信号响应均高于。采用 模式采集，通过 全扫描确认各个毒素的准分子离子，各毒素化学结构与二级质谱碎裂途径见图。对各个毒素二级碎裂离子进行扫描优化得到最佳碰撞能量及偏差电压，每个毒素得到的离子对信息均能通过碎裂解析找到对应的碎裂部位。比较在优化后的仪器条件下不同基质中毒素的响应，基质干扰等问题，确定了用于定量和定性的产物离子，见表。（）（，）（）（）（，）（）图 种蘑菇毒素的结构及质谱碎裂解析 色谱条件优化 在流动相优化过程中，对比了 甲酸水溶液甲醇、甲酸水溶液乙腈，发现乙腈作为有机相时毒素信号响应及峰形普遍比用甲醇好。采用甲酸铵溶液，其他文献多采用乙酸铵溶液或甲酸水溶液作为水相对 种鹅膏肽类毒素进行检测。本研究以乙腈为有机相，比较了水相为水、甲酸水溶液、甲酸铵溶液、乙酸铵溶液（含 甲酸）时的效果，发现以 乙酸铵（含 甲酸）为流动相水相时，所有毒素的信号响应和峰形的综合效果最好，故选择 乙酸铵（含 甲酸）乙腈为最终流动相。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素互为同分异构体，需要在色谱上分离开，为此比较了在相同条件下 （，日本岛津公司）、（，日本岛津公司）种色谱柱的分离效果（见图）。结果表明，柱的分离效果较差，且峰形不理想，柱和 柱较为理想，分离效果相当，柱对色胺类（脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺）的保留效果略好，综上，选择 柱。第 期刘磊琦，等：高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素图 种色谱柱分离 种蘑菇毒素的 色谱图的比较 样品前处理条件的优化 提取溶剂、及温度的选择 脱磷裸盖菇素不稳定，在光和空气中会快速地分解，本研究在样品前处理过程中，通过加入抗坏血酸来提高脱磷裸盖菇素的稳定性。鹅膏肽类毒素均为多肽类化合物，采用甲醇提取，其他文献则多采用乙腈、水提取；脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺均属于小分子极性化合物，易溶于水。为实现蘑菇中 种蘑菇毒素的提取，对比了水、甲醇、乙腈、甲醇水溶液、乙腈水溶液的提取效果，结果见图。甲醇对 的提取效果略低于 甲醇水和 乙腈水溶液，对其他鹅膏图 提取条件对蘑菇样品中蘑菇毒素提取效率的影响（）（）；：；肽类毒素的提取效果均最佳，提取率略大于 乙腈水溶液，鹅膏肽类毒素属于相对分子质量较大的极性化合物，相对于甲醇和水，极性更小的乙腈提取率明显更低；对脱磷裸盖菇素及蟾蜍色胺，乙腈和色谱第 卷 乙腈水溶液的提取效果最佳。综上，选择甲醇作为最佳的提取溶剂。不同的鹅膏肽类毒素具有不同的水溶性，因此推测溶液 对其提取效果有一定影响。本研究对比了在不同 （、）下甲醇溶液对目标物的提取效果，以甲酸溶液及氨水调节提取液的 值（甲酸甲醇对应 ，甲酸甲醇对应 ，甲酸甲醇对应 ，氨水甲醇（，）对应 ，氨水甲醇（，）对应 ），结果见图。随着 上升，所有毒素的提取效果均有不同程度的下降，为，即 甲酸甲醇作为提取溶液时所有毒素提取效果最佳。溶剂 对脱磷裸盖菇素提取的影响较大，对 鹅膏毒肽提取的影响较小。鹅膏肽类毒素性质稳定，耐高温、耐干燥和耐酸碱，普通烹调加工无法降低其毒性。考察了在 水浴下提取 种毒素时其提取效果的差异（见图），脱磷裸盖菇素在 范围内，随着温度升高，其峰面积呈下降趋势（），这说明脱磷裸盖菇素不耐热，其余 种毒素在不同温度下提取时的峰面积基本一致，无显著性差异（）；综合考虑，确定提取温度为 。另外试验了 下提取不同时间（）对蘑菇毒素含量的影响（见图），大多数毒素在 后峰面积基本不变，表明提取达到动态平衡。固相萃取填料的比较 蘑菇中含有较多的多糖、氨基酸、多肽及有机酸等，基质复杂，以及其他文献，多采用亲水亲脂平衡机制的 柱作为鹅膏肽类毒素测定的净化柱，对于脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的测定，多采用离子交换型净化柱。因此本研究考察了 种不同类型固相萃取柱的效果，前期试验发现，在提取液上样后，脱磷裸盖菇素未与 填料作用，随溶液直接流出；考虑脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺在酸性条件下可形成阳离子，故比较了具有阳离子交换和反相保留双重作用的 种填料（弱阳离子交换型）、，并用加标 水 平 为 的香菇干粉为基质进行试验，发现 对 种毒素净化的综合效果最佳，结果见图。淋洗和洗脱条件的优化 对 净化柱的淋洗液进一步优化，比较方案（依次用 、各 淋洗）和方案（依次用 、甲醇（含 ）各 淋洗）的效果。方案 中 种毒素的回收率范围为，方案 的回收率为 ，可见两种淋洗条件下 种毒素的回收率无明显差异。排除掉脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的内标校正作用后，脱磷裸盖菇素受淋洗溶剂的影响大，采用方案 条件淋洗时，其峰面积仅为方案 的 （结果见图），故选择方案 更适合。色胺类毒素用 净化时，文献多采用氨水甲醇洗脱，本文以氨水甲醇（，）洗脱，并对比洗脱体积（）的效果，结果见图。洗脱液为 时，种鹅膏肽类毒素的回收率为，色胺类毒素的回收率为，效果最佳。洗脱液为 时，种鹅膏肽类毒素的回收率降至 ，这可能是由于随着洗脱体积的增加，导致样品中更多杂质被洗脱出来，基质抑制效应增加，用外标法计算时其回收率较低；种色胺类毒素的回收率为 ，回收率无明显差异，这可能因为内标法校正后减弱了基质干扰作用。图 采用 种 填料净化时 种蘑菇毒素的回收率（）（）图 两种淋洗方式下脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的峰面积（）（）：第 期刘磊琦，等：高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素图 洗脱体积对 种蘑菇毒素回收率的影响（）（）表 个加标水平下香菇干粉中 种蘑菇毒素的加标回收率及其（）（），：，；，；，方法学考察 线性范围、检出限及定量限 按 节处理得到空白基质溶液，取 种蘑菇毒素混合标准使用液适量和 内标混合标准使用液用空白基质溶液稀释，配制成基质匹配混合标准溶液。鹅膏毒肽、鬼笔毒肽的定量采用基质匹配外标法，以毒素的质量浓度（，）和峰面积（）拟合线性回归方程；脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的定量采用同位素内标法，以毒素的质量浓度（，）与峰面积比值（）拟合线性回归方程，结果 见 表。鹅 膏 毒 肽、鬼 笔 毒 肽（）、脱磷裸盖菇素（）、蟾蜍色胺（）在线性范围内相关系数（）均，满足测定要求。取空白香菇干粉进行加标回收试验，以离子对的信噪比 和 时的含量分别作为 和，种毒素的结果见表。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素、鹅膏肽类毒素的 分别为、，分别为 、和 。中称样量（干粉）为 时，种鹅膏肽类的 均为 ，均为 。本研究的称样量为 ，种鹅膏肽类的检出限与食品补充检验方法相当，定量限低于该方法，证明本研究方法的灵敏度较高，需要的样品量更少。此外，新建立的方法还能额外检测野生菌中的色胺类毒素（脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺）。表 蘑菇干粉中 种毒素的线性关系、检出限和定量限 ，（）（）（）：；：；：，准确度与精密度 以不含目标毒素的香菇干粉进行加标回收率试验，加标水平为 时，种毒素的平均回收率为 ，为 （）（见表）。根据 ，当目标物的含量 时，回收率允许范围为 ，且重复测定的，这说明本方法的重复性和准确度均理想，满足实际样品的分析要求。野生蘑菇中 种蘑菇毒素分布的调查研究 年福建省首次开展了野生蘑菇的风险监测，由全省 个设区市采集 份野生蘑菇，本实验室采用核糖体 内转录间隔区（）分子条形码技术进行了种属鉴定（经中国科学院昆明植物研究所杨祝良教授团队核实），并采用本方法测定了野生蘑菇样品中的 种蘑菇毒素。结果显色谱第 卷示，在 份样品中检出了蘑菇毒素，编号为 的样品采自龙岩市，经鉴别为拟灰花纹鹅膏（），从中检出、鹅膏肽类毒素，其含量分别为、；编号为 的样品采自莆田市，经鉴别为口蘑科（）蘑菇，从中检出脱磷裸盖菇素，含量为 ，未检出其他 种蘑菇毒素。这两个野外环境下的蘑菇样品分别见图 和图，其干粉提取物的 色谱图（各稀释 、倍后测定）分别见图 和图。采用 方法和本方法对拟灰花纹鹅膏干粉中鹅膏肽类毒素含量进行对比（结果见图），二者测定的鹅膏肽毒素含量无统计学差异（），再次证明了本方法的可靠性。图 阳性野生蘑菇及其含有的蘑菇毒素的 色谱图 ；图 本方法与 法检测拟灰花纹鹅膏干粉中鹅膏毒素含量的比较（）（）结论 采用强阳离子交换 净化柱减少了蘑菇基质对毒素质谱测定的干扰，通过优化前处理条件，建立了蘑菇中 种鹅膏肽类和 种色胺类毒素的 检测技术。经方法验证并与已有标准方法对比，结果表明所建立方法结果可靠，重复性好，灵敏度较高，可对蘑菇样品中 种鹅膏肽类和 种色胺类蘑菇毒素进行简便、快速、准确的分析。参考文献：，：，：，（）：，：，（）：，（）：李林静，李高阳，谢秋涛 中国食品卫生杂志，（）：第 期刘磊琦，等：高效液相色谱串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素 ，（）：杨祝良 云南植物研究，（）：，（）：，（）：王锐，高永军，丁凡，等 中国公共卫生，（）：，（）：，（）：杨柳，向平，党永辉，等 中国司法鉴定，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：许莹，李春盛，郭维静 预防医学论坛，（）：，（）：许欣欣，陈春晓，仲岳桐，等 食品安全质量检测学报，（）：，（）：魏佳会，陈佳，吴弼东，等 分析化学，（）：，（）：郎乐，王庆峰，刘斌，等 食品安全质量检测学报，（）：，（）：柳洁，黄海燕，曾灼祥，等 中国卫生检验杂志，（）：，（）：贺丽迎，唐晓琴，赵舰，等 色谱，（）：，（）：张秀尧，蔡欣欣，张晓艺，等 色谱，（）：，（）：方力，邱凤梅，余新威 色谱，（）：，：国家市场监管总局 食品补充检验方法，蘑菇中 鹅膏毒肽等 种蘑菇毒素的测定 ：，（）：徐小民，郑熠斌，黄百芬，等 中国食品卫生杂志，（）：，（）：肖绍震，林锋，傅武胜，等 食品科学，（）：，（）：林子豪，罗鼎峰，戚平，等 食品安全导刊，（）：，（）：傅武胜，唐昌东，林锋，等 海峡预防医学杂志，（）：