PI染色法测细胞周期.pptx

n正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；第1页/共46页n进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。第2页/共46页第3页/共46页n通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。第4页/共46页G2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2N2N4N4NNormal Cell Cycle 第5页/共46页n染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个 细 胞。其 最 佳 浓 度 为50ug/106 个细胞。第6页/共46页细胞浓度及质量要求n单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。n制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。第7页/共46页操作步骤操作步骤 n取一瓶生长期的A549细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶消化15分钟（以镜下观察决定）n加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min，去上清。n加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇，混匀后固定30min。第8页/共46页n加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去上清液。n加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。n加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30minn上机检测。第9页/共46页影响荧光染色的因素影响荧光染色的因素 n温度：温度高于20时，即出现温度淬灭。n2、PH：PI在7.27.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。n3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。n4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。第10页/共46页什么是流式细胞仪n流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM)是一项集激光技术电子物理技术光电测量技术计算机技术以及细胞荧光化学技术单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。第11页/共46页什么是流式细胞术n简单说就是自动化的萤光显微镜n测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激光束时发出的光学信号的一个系统第12页/共46页流式细胞仪特点及检测标本n特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；n可检测的样本种类多样n(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞n(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 第13页/共46页流式细胞仪的结构n液流系统n将细胞引导至检测点n光学系统n产生并收集光学信号n电子系统n将光信号转换成电信号，使之数字化，输入计算机并分析n分选系统第14页/共46页液流系统n流动室n鞘液n酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。n样本流n单细胞悬液，浓度51051 106/mL第15页/共46页液流系统 n-FLOW CELL(流动室)：是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交。Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液鞘液第16页/共46页光学系统n光学激发系统n激光 激光(Laser,light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相 干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的 光照n488nm，635nmn光学信号n光学收集系统n光学滤片n透镜第17页/共46页光学信号n光学信号有两种n1.散射光信号：前向角散射光 (FSC,Forward Scatter)侧向角散射光 (SSC,Side Scatter)n2.荧光信号(488nm,635nm)第18页/共46页光学信号n信号产生-散射光信号n当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。第19页/共46页光学信号光学信号第20页/共46页光学信号n信号产生n前向角散射光信号(FSC)：反应了细胞或颗粒大小的不同。n侧向角散射光信号(SSC)：反应了细胞或颗粒内部的复杂程度或颗粒性的不同。n散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数，反应细胞的大小和内部结构。第21页/共46页前向角散射光信号前向角散射光信号第22页/共46页侧向角散射光信号侧向角散射光信号第23页/共46页n双参数散点图第24页/共46页信号产生-荧光信号n荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。第25页/共46页n荧光信号第26页/共46页荧光信号第27页/共46页荧光信号第28页/共46页光学收集系统nFCM的光学系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成第29页/共46页光学收集系统n滤片n长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光第30页/共46页n短通滤片(SP):只允许特定波长以下的光通过。第31页/共46页流式细胞仪带通滤片（BP）：允许一定带宽波长的光通过。第32页/共46页第33页/共46页光学系统第34页/共46页基本图形n单参数直方图：细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以直方图来显示。n双参数数据图：用于表达同一细胞两个参数与细胞数量间的关系。第35页/共46页第36页/共46页流式细胞术的应用n细胞生理学研究n细胞膜表面标记n胞内标记n细胞周期分析n凋亡分析n分选nCBA第37页/共46页细胞生理学研究n细胞相对大小和颗粒性n胞内pH值检测nCa+流动性检测n膜电势检测n细胞活性检测n细胞活力(增殖能力)的检测第38页/共46页荧光信号的面积和宽度n所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A),这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。第39页/共46页n宽度（FL2-W）常用来区分双联体细胞。由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高，影响测量准确性第40页/共46页ModFit LTn是由美国Verity Software House 公司设计，专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件。它通过对DNA 含量直方图进行曲线拧合，能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、G1/S/G2+M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的DNA 指数(DNA Index)、及分析凋亡细胞亚二倍体所占的比例。此外，2.0 版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分別进行同步化细胞和增值细胞的研究(Synchronized or Drug-Perturbed Cells)第41页/共46页第42页/共46页第43页/共46页第44页/共46页第45页/共46页第46页/共46页