甘蓝型油菜BnKNOX基因家族的鉴定与分析.pdf

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2023,49(11):29913006 http:/zwxb.chinacrops.org/ISSN 0496-3490;CN 11-1809/S;CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家自然科学基金项目(32272055,31972963),江苏省研究生实践创新计划项目(SJCX21_1602)和江苏省“青蓝工程”项目资助。This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(32272055,31972963),the Graduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship(SJCX21_1602),and the Qinglan Project of Jiangsu Province.*通信作者(Corresponding author):蒋金金,E-mail: 第一作者联系方式:E-mail: Received(收稿日期):2023-02-10;Accepted(接受日期):2023-04-17;Published online(网络出版日期):2023-04-24.URL:https:/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND license(http:/creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).DOI:10.3724/SP.J.1006.2023.34027 甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的鉴定与分析 陈吴钧 刘江栋 蒋凯旋 王幼平 蒋金金*扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州 225009 摘 要:植物特异的 KNOTTED-LIKE HOMEOBOX(KNOX)蛋白属于转录调控因子家族,该家族在植物生长发育过程和各种胁迫应答中发挥着重要的作用。KNOX蛋白中存在 4个保守的结构域:TALE(three amino acid loop extension)类型的 HD(homeodomain)、ELK 结构域,以及 2 个亚结构域 KNOX1 和 KNOX2。目前,甘蓝型油菜的 BnKNOX 基因家族还未有系统的研究报道。本研究通过生物信息学分析鉴定获得甘蓝型油菜的 36 个 BnKNOX 家族成员。通过序列比对和系统发育树分析,将其分为 3 个亚家族(I、II 和 M 类)。进化分析表明,全基因组复制(whole genome duplication,WGD)和片段复制(segmental duplication)是 BnKNOX 基因家族扩张的主要动力。基于甘蓝型油菜不同发育时期组织/器官的 RNA-seq 分析发现,该基因家族的 BnKNAT25/26/29/30 在胚乳和种子发育过程中特异表达,而BnKNAT31/32/34 在成熟种子中高表达。通过 BnKNOX 家族的顺式作用元件分析和非生物胁迫条件下的表达模式分析,本文鉴定获得 17 个响应干旱和渗透胁迫的 BnKNOX 成员。关键词:甘蓝型油菜;KNOX;基因家族;表达模式;非生物胁迫 Identification and analysis of BnKNOX gene family in Brassica napus CHEN Wu-Jun,LIU Jiang-Dong,JIANG Kai-Xuan,WANG You-Ping,and JIANG Jin-Jin*College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,Jiangsu,China Abstract:The plant specific KNOTTED-LIKE HOMEOBOX(KNOX)protein is a transcription factor family that plays an im-portant role in plant growth and development,as well as responses to various stresses.KNOX proteins contain four conserved domains a three amino acid loop extension(TALE)type homeodomain(HD),ELK domain,and two subdomains(KNOX1 and KNOX2).At present,the comprehensive study of BnKNOX genes in Brassica napus has not been reported yet.In this study,36 BnKNOX family members were identified in B.napus genome via bioinformatic analyses,which were classified into three sub-families(I,II,and M-type)based on sequence alignment and phylogenetic analyses.Evolutionary analysis showed that the whole genome duplication(WGD)and segmental duplication were the main driving forces for the expansion of BnKNOX gene family.Based on the RNA-seq data of developing tissues and organs of B.napus,BnKNAT25/26/29/30 were specifically ex-pressed in endosperm and developing seeds,while BnKNAT31/32/34 were highly expressed in mature seeds.We analyzed the cis-acting elements and expression pattern of BnKNOXs under various abiotic stresses,and identified 17 BnKNOX members that might be involved in drought and osmotic stress responses.Keywords:Brassica napus;KNOX;gene family;expression pattern;abiotic stress KNOX(KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX)是一类编码植物特异转录因子的基因家族,其特征是在HD(homeodomain)的螺旋 1 和螺旋 2 之间存在一个TALE(three amino acid loop extension)基序1-3。KNOX 家族的命名源自玉米中首次鉴定的编码homeobox 蛋白的 KNOTTED1(KN1)基因,该基因的2992 作 物 学 报 第 49 卷 功能获得性突变可引起玉米叶片的侧脉、叶舌分化异常4。现有研究表明 KNOX 基因家族广泛存在于陆生植物和绿藻中5。KNOX 蛋白均包含 4 个保守结构域:位于 C 末端的 TALE 类型 HD 结构域,负责识别下游靶基因的启动子序列;位于 HD 上游的ELK 结构域,可能作为核定位信号参与转录抑制调控和蛋白质互作;MEINOX 结构域位于 N 端,包含 2个亚结构域 KNOX1 和 KNOX2,可参与蛋白互作和同源二聚化、以及调控靶基因表达6-8。陆生植物的KNOX 家族成员可分为 2 类(I 和 II),其中 I 类成员主要在茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)中表达,在胚和其他组织中低表达9。与 I 类成员相比,II 类 KNOX 基因具有更广泛的表达模式,其在开花植物的分化组织和成熟器官中均有表达,而在分生组织中不表达10。此外,在一些双子叶植物(如拟南芥)中还存在缺乏 ELK-HD 结构域的 KNOX亚家族,即 KNAT(knotted-like from Arabidopsis thaliana)M 类11。拟南芥中的 KNOX 基因家族包含 STM(shoot meristemless)、KNAT1、KNAT2 和 KNAT6 4 个 I 类成员,KNAT3、KNAT4、KNAT5 和 KNAT7 4 个 II 类成员,以及 1 个 M 类成员(KNATM)11。目前对 I 类KNOX 基因的研究较多,该类基因主要在植物生长发育中起重要调控作用12-16。细胞分裂素可诱导SAM 中 STM 和 KNAT1 的表达水平;STM 可通过促进 IPT(isopentenyl transferase)和 ARR5(authentic response regulators 5)基因表达,参与调控SAM中细胞分裂素的合成17-19。此外,STM 在诱导心皮形成和发育过程中也具有重要的作用20。STM 通过正调控KNAT1 和 KNAT2 表达,维持干细胞稳态和心皮发育,且三者存在功能冗余21-22。KNAT6 与 STM 在维持SAM 和器官分化过程中存在功能冗余,且 KNAT6可通过 STM/CUC2(cup-shaped cotyledon 2)通路参与调控胚的边界建立23。对被子植物叶片发育调控的研究表明,过表达 I 类 KNOX 基因可导致叶片数量增多;而该类基因的功能缺失会使叶片过早分化,导致叶片发育和功能异常24-29。拟南芥的II类KNOX基因主要促进组织/器官分化、抑制 SAM 分生能力,其功能与 I 类 KNOX 基因相反。II 类 KNOX 基因的双突变体和多突变体的子叶叶柄增长、叶片变窄、叶齿增多29。KNOX 家族基因在调控植物的非生物胁迫应答方面也具有重要作用30-32。大豆(Glycine max)的 GmSBH1(H1 Sbh1)可参与调控植株生长发育,且在大豆对高温和高湿胁迫的响应中发挥重要作用30,GmSBH1 可能通过与 GmBLH4(bel1-like homeodomain 4)形成异源二聚体调控植物发育和对水分胁迫的响应31。杨树(Populus alba P.glan-dulosa)中,KNOX 家族成员 PagKNAT2/6b 可通过抑制赤霉素(gibberellin,GA)合成,降低杨树的株高、茎节数、节间长度和叶面积,提高植株的耐旱性32。甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)是芸薹属的重要油料作物,在世界各地广泛种植,是植物油、生物柴油、生物燃料和医药产品的重要来源之一33-34。该物种是约 7500 年前由白菜型油菜(Brassica rapa,AA,2n=20)和甘蓝(Brassica oleracea,CC,2n=18)通过自然杂交和染色体加倍产生的异源四倍体34。甘蓝型油菜在多倍化过程中经历了复杂的基因复制、染色体倒位和异位等事件,促进了基因家族的多样化,提高了物种的适应性35-36。目前,关于甘蓝型油菜 KNOX 基因家族的研究尚未有报道。本研究全面分析了甘蓝型油菜中 36 个 KNOX 成员的序列结构、保守基序、染色体定位、表达模式及其在基因组复制过程中的共线性关系,旨在了解响应非生物胁迫的 KNOX 基因家族成员,为甘蓝型油菜耐逆基因挖掘和耐逆性状改良奠定基础。1 材料与方法 1.1 甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族成员的鉴定 从基因组数据库(http:/s.fr/brassicanapus)34中提取甘蓝型油菜的基因组和蛋白序列,以植物转录因子数据库(http:/planttfdb.gao-lab.org/)中 9个拟南芥 KNOX蛋白为参考序列,利用BLASTP 同源检索获得甘蓝型油菜的 KNOX 蛋白序列。根据 Pfam(http:/pfam-legacy.xfam.org/)数据库中KNOX 蛋 白 的4个 保 守 结 构 域KNOX1(PF03790)、KNOX2(PF03791)、ELK(PF03789)和HD(PF00046)37,利用 HMMER(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)鉴定油菜基因组中含有上述结构域的蛋白38,并利用 NCBI-CDD(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)39筛选至少包含一个及以上结构域的蛋白作为甘蓝型油菜 BnKNOX 家族成员。1.2 BnKNOX 家族的理化性质和亚细胞定位分析 通过在线工具 IPC(http:/isoelectric.org/)计算BnKNOX 蛋白的分子量(molecular weight,MW)和理论等电点(isoelectric point,pI),利用在线工具 WoLF 第11期 陈吴钧等:甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的鉴定与分析 2993 PSORT(https:/wolfpsort.hgc.jp/)预测 BnKNOX 蛋白的亚细胞定位。1.3 KNOX 家族的系统进化和基因结构分析 从芸薹属基因组数据库(https:/www.brassica.info/)和拟南芥数据库(https:/www.arabidopsis.org/)获得白菜型油菜、甘蓝和拟南芥 KNOX 家族成员的序列,利用 ClustalX(http:/www.clustal.org/clustal2/)对 KNOX 蛋白序列进行比对,并利用 Jalview(http:/www.jalview.org/)软件对比对结果进行编辑。利用 MEGA7.0(https:/ KNOX 的系统发育树,选择 p-distance 和成对删除选项,并将 Bootstrap 参数设置为 1000。基于甘蓝型油菜基因组数据库(http:/s.fr/brassicanapus)中提取的BnKNOX 序列信息,利用 GSDS 2.0 程序(http:/gsds.gao-lab.org/)分析 BnKNOX 的外显子和内含子,利用MEME(http:/meme-suite.org/tools/meme)分析BnKNOX 蛋白的保守基序,并通过 TBtools 软件对基因结构和蛋白保守基序进行可视化分析40。1.4 BnKNOX 基因的启动子顺式作用元件分析 从甘蓝型油菜基因组数据库中获得 BnKNOX 基因编码序列(coding sequence,CDS)上游 2000 bp 的基因组 DNA 序列,然后利用 PlantCare(http:/bio-informatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对BnKNOX 基因启动子区域的顺式作用元件进行分析,使用 TBtools 软件对元件的数量与分布进行可视化分析40。1.5 BnKNOX 基因的染色体定位和共线性分析 从甘蓝型油菜基因组数据库获得每条染色体的长度和 BnKNOX 基因的位置信息,利用 MG2C(http:/mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)绘制 BnKNOX 的染色体定位图。利用 MCScanX 分析甘蓝型油菜、拟南芥、白菜型油菜和甘蓝中 KNOX 基因的复制事件和共线性关系。利用 TBtools 对 BnKNOX 基因家族组间和组内的共线性关系进行可视化分析40。1.6 BnKNOX 基因的组织表达分析 本研究收集了甘蓝型油菜株系“J9712”不同发育期的组织/器官,包括根、子叶、下胚轴、真叶、茎、茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)、花苞(3 mm)、花、胚乳、授粉后(days after pollination,DAP)14 d 的角果、以及不同发育时期(21、28、35、42 和 50 DAP)的种子,基于不同样本的 RNA-seq 分析(3 个 生物 学 重复),根据 每个基 因 的 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)的 log10转化值分析 BnKNOX 的组织表达模式。1.7 植物材料生长、干旱和渗透胁迫处理 为了研究 BnKNOX 基因在干旱和渗透胁迫下的表达模式,本研究将“J9712”种子经 70%乙醇和 10%次氯酸钠消毒后,分别接种于含 15%PEG-6000 或150 mmol L1甘露醇的 1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基、以及 1/2 MS 培养基(对照组),于 16 h 光照/8 h 黑暗、22培养 14 d,并分别于接种后第 0、3、5、7、9 和 14 天收集叶片,每个时间点包括 3 个生物学重复,所收样本用于 BnKNOX 基因的表达水平分析。1.8 RNA 提取、cDNA 合成和 qPCR 分析 利用 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(Vazyme,中国)试剂盒提取叶片总 RNA,利用HiScript III RT SuperMix(Vazyme,中国)试剂盒反转录获得 cDNA。利用 Primer Premier 5 设计BnKNOX基因的qPCR引物(表1),用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,中 国)进 行BnKNOX 基因的 qPCR 分析。以 BnActin 为内参基因,使用 2Ct法计算基因的相对表达量,每个样本包含 3 个生物学重复。表 1 本研究中用到的 qPCR 引物 Table 1 qPCR primers used in this study 基因名称 Gene name 正向引物序列 Forward primer sequence(53)反向引物序列 Reverse primer sequence(53)BnKNAT1 AGCCATCCACAATACTCAAGAA CGCCGTAATTTTATCAACCACT BnKNAT2 AGATTAGCATGTTGTGTCAGGA ATCCACTGTACTTCTTCAGCAA BnKNAT3 ACCTGAGGTGGTCGATAAAATT AAGAAACGACCCACATGAATTG BnKNAT4 CGAAAATCGCTTCTCATCCTTT CGTTTCGATCTTGTTCAGGAAA BnKNAT5 TTCTTCGGAGAGTCTTATGTCG GAATCTCTTCCAACACATACGC BnKNAT11 CTCTCATCCACTATACGAGCAG AGTGGTCAAGCTCCTTATCATC BnKNAT12 GTGACGCCATGGAAAACATTAC CTGCTCGTATAGTGGATGAGAG 2994 作 物 学 报 第 49 卷 (续表 1)基因名称 Gene name 正向引物序列 Forward primer sequence(53)反向引物序列 Reverse primer sequence(53)BnKNAT13 CACTATACGAACGGCTTTTGTC GTCCATAGTAGAGTACTTGGCC BnKNAT18 GATGGAATGTACGGCTTTCATC AGTCGGAAGGAAACATCAGATT BnKNAT19 GAAAGCTACCAAGAGAAGCAAG CAAAAGGCATATTCTCGGACTG BnKNAT20 CCTTCTGATTACCAAACCTTGC TACAAAGGATGACAAGCGATCT BnKNAT22 GTCTCTCTCGGTATCATCAAGG CCTTGCGAGATCCGACTTATAT BnKNAT23 ATGTGACTACTCAGATAAGCCG GGATACGAAGGATGACAAGCTA BnKNAT24 TGACACAATGACAATGGAGGTA ATCTTCGCATATTTGTTTCCCG BnKNAT25 TACCATGTGCGAGCAATTATTG GCTGTTCTTTGAAGCTACACAA BnKNAT33 TAAGGGAGTTGAAGGAAGCAAT TAGCACCGAATATAGCTGTCAG BnSTM2 GTAGTAATGGACGCAACACATC GTGCAACGTTCCTAAGTATTCC 2 结果与分析 2.1 BnKNOX 家族的全基因组鉴定与蛋白理化性质分析 甘蓝型油菜的KNOX蛋白包含4个保守结构域,从 N 端到 C 端依次为 KNOX1、KNOX2、ELK 和HD 结构域(图 1)。油菜中包含 KNOX1、KNOX2、ELK 或 HD 结构域的成员数分别为 31、31、22、328个,但含 HD 结构域的基因中仅 26 个成员含其他结构域,最终获得 36 个 BnKNOX 成员(图 1)。本研究从植物转录因子数据库中获得 9 个拟南芥的 AtKNOX 蛋白,通过序列同源比对也从甘蓝型油菜基因组获得 36 个 BnKNOX 成员。结合上述 2 种分析方法,本研究最终鉴定到 36 个甘蓝型油菜 KNOX蛋白(表 2),其中 11、6、17 个成员分别包含 2、3和 4 个结构域,而 BnKNAT27/29 仅具有 KNOX1 结构域。BnKNOX 蛋白长度为 102444 个氨基酸不等,平均蛋白长度为 286 个氨基酸,其中 BnKNAT9 最长,而 BnKNAT29 最短;分子质量为 11.0948.91 kD,平均分子质量 32.24 kD。BnKNOX 蛋白的理论等电点为 4.358.25。通过 WoLF PSORT 预测表明 36 个BnKNOX 蛋白都定位于细胞核内(表 2)。(图 1)第11期 陈吴钧等:甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的鉴定与分析 2995 图 1 甘蓝型油菜 BnKNOX 蛋白结构域的分布和组成 Fig.1 Distribution and composition of the characteristic motifs in BnKNOX proteins A:BnKNOX 蛋白结构示意图;B:KNOX1 结构域;C:KNOX2 结构域;D:ELK 结构域;E:HD 结构域。A:the structure diagram of motifs in BnKNOX proteins;B:KNOX1 domain;C:KNOX2 domain;D:ELK domain;E:HD domain.表 2 甘蓝型油菜 BnKNOX 蛋白家族的基本信息 Table 2 Information of BnKNOX protein members in Brassica napus 基因号 Gene ID 基因名 Gene name拟南芥号 Arabidopsis thaliana locus 蛋白长度 Protein length(AA)分子量 Molecular weight(kD)等电点Isoelectric point(pI)亚细胞定位 Localization BnaA03g23610D BnKNAT1 AT4G08150.1 402 46.36 5.82 细胞核 Nucleus BnaC03g28030D BnKNAT2 AT4G08150.1 193 23.07 7.55 细胞核 Nucleus BnaCnng59830D BnKNAT3 AT4G08150.1 349 40.19 5.89 细胞核 Nucleus BnaA02g14950D BnKNAT4 AT1G70510.1 327 36.94 4.81 细胞核 Nucleus BnaC02g19900D BnKNAT5 AT1G70510.1 327 36.90 4.80 细胞核 Nucleus BnaA02g32110D BnKNAT6 AT5G25220.1 420 46.29 5.40 细胞核 Nucleus BnaA06g27560D BnKNAT7 AT5G25220.1 299 33.43 5.82 细胞核 Nucleus BnaC02g40790D BnKNAT8 AT5G25220.1 404 44.84 5.44 细胞核 Nucleus BnaC07g29530D BnKNAT9 AT5G25220.1 444 48.91 5.11 细胞核 Nucleus BnaA02g00810D BnKNAT10 AT5G11060.1 393 44.28 5.65 细胞核 Nucleus BnaA03g03190D BnKNAT11 AT5G11060.1 386 43.15 5.67 细胞核 Nucleus BnaC03g04580D BnKNAT12 AT5G11060.1 302 33.77 5.99 细胞核 Nucleus BnaCnng20070D BnKNAT13 AT5G11060.1 393 44.23 5.62 细胞核 Nucleus BnaA01g04870D BnKNAT14 AT4G32040.1 374 41.91 5.56 细胞核 Nucleus BnaA03g51900D BnKNAT15 AT4G32040.1 382 43.18 5.48 细胞核 Nucleus BnaC01g06410D BnKNAT16 AT4G32040.1 374 41.86 5.71 细胞核 Nucleus BnaC07g43650D BnKNAT17 AT4G32040.1 400 45.35 5.37 细胞核 Nucleus BnaA08g20500D BnKNAT18 AT1G23380.1 208 22.92 4.49 细胞核 Nucleus BnaA08g20510D BnKNAT19 AT1G23380.1 121 14.03 8.25 细胞核 Nucleus BnaA09g31100D BnKNAT20 AT1G23380.1 235 26.11 4.41 细胞核 Nucleus BnaAnng30720D BnKNAT21 AT1G23380.1 204 23.26 5.96 细胞核 Nucleus BnaC05g18670D BnKNAT22 AT1G23380.1 221 24.45 4.35 细胞核 Nucleus BnaC08g06320D BnKNAT23 AT1G23380.1 314 35.23 5.10 细胞核 Nucleus BnaCnng70390D BnKNAT24 AT1G23380.2 205 23.48 6.22 细胞核 Nucleus BnaA09g12980D BnKNAT25 AT1G62990.1 293 33.02 5.62 细胞核 Nucleus BnaA09g52990D BnKNAT26 AT1G62990.1 294 33.10 5.85 细胞核 Nucleus BnaC04g20090D BnKNAT27 AT1G62990.1 104 11.46 4.90 细胞核 Nucleus BnaC04g20110D BnKNAT28 AT1G62990.1 222 25.73 7.84 细胞核 Nucleus BnaC09g12900D BnKNAT29 AT1G62990.1 102 11.09 5.15 细胞核 Nucleus BnaCnng51440D BnKNAT30 AT1G62990.1 294 33.09 5.78 细胞核 Nucleus BnaA06g09570D BnKNAT31 AT1G14760.2 141 16.25 4.57 细胞核 Nucleus BnaA09g45470D BnKNAT32 AT1G14760.2 135 15.31 4.36 细胞核 Nucleus BnaC05g10940D BnKNAT33 AT1G14760.2 137 15.70 4.95 细胞核 Nucleus BnaC08g39310D BnKNAT34 AT1G14760.2 135 15.25 4.37 细胞核 Nucleus BnaA09g13310D BnSTM1 AT1G62360.1 383 43.11 5.82 细胞核 Nucleus BnaC09g13580D BnSTM2 AT1G62360.1 383 43.20 5.92 细胞核 Nucleus 2996 作 物 学 报 第 49 卷 2.2 BnKNOX 家族的系统进化分析 本研究构建了 BnKNOX 成员与 9 个拟南芥AtKNOX、17 个甘蓝 BoKNOX 和 16 个白菜型油菜BrKNOX 的系统发育树,表明 KNOX 蛋白可分为 3类,即 I 类、II 类和 M 类(图 2)。其中,II 类的 KNOX成员最多,包括 18 个 BnKNOX、4 个 AtKNOX、8个 BoKNOX 和 7 个 BrKNOX,且 BnKNAT9 和BnKNAT7、BnKNAT8 和 BnKNAT6、BnKNAT17 和BoKNAT15、BnKNAT15 和 BrKNAT7 有较高的相似性。II 类亚族成员中 BnKNAT22 与 BoKNAT9、BnKNAT4 与 BrKNAT2、BnKNAT5 与 BoKNAT2 具较 高 的 相 似 性。在 M 亚 族 中,BnKNAT33 和BoKNAT14、BnKNAT32 和 BrKNAT15、BnKNAT34和 BoKNAT15 有较高的相似性。图 2 甘蓝型油菜、拟南芥、甘蓝和白菜型油菜中 KNOX 蛋白的系统进化分析 Fig.2 Phylogenetic relationship of KNOX proteins in Arabidopsis thaliana,Brassica rapa,B.oleracea,and B.napus 2.3 BnKNOX 基因结构和保守基序分析 外显子-内含子结构变化在基因功能分化中起着重要作用41。基因结构分析表明,BnKNOX 的外显子数目为 17 个。其中 BnKNAT29 仅含有 1 个外显子,而 BnKNAT9 含有 7 个外显子(图 3)。BnKNOX家族成员包含 15 个保守的蛋白质基序,每个 Motif由 1050 个氨基酸构成。在同一亚族中,BnKNOX的保守基序的结构相似,其中 Motif2 和 Motif3 在BnKNOX 成员中普遍存在(BnKNAT19/21/24/27/29除外)(图 3)。表明甘蓝型油菜 BnKNOX 基因在进化上较为保守,且可能存在个别成员的功能分化。2.4 BnKNOX 基因的染色体分布和共线性分析 本研究根据甘蓝型油菜 19 条染色体的注释信息,对所鉴定的 36 个 BnKNOX 基因进行染色体定位分析(图 4),发现分别有 15 个基因定位于 A 和 C 亚基因组上,另有 6 个 BnKNOX 基因并未定位于特定的染色体位置,包括 1 个位于 A09_random 染色体、1 个位于 Ann_random 染色体、4 个位于 Cnn_random 第11期 陈吴钧等:甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的鉴定与分析 2997 图 3 甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的基因结构和保守基序分析 Fig.3 Gene structure and motif composition of the BnKNOX gene family in Brassica napus A:BnKNOX 蛋白的系统进化分析;B:BnKNOX 蛋白的保守基序分析,Motif 115 为不同颜色代表的基序组成;C:BnKNOX 基因结构。UTR:非翻译区;CDS:编码区。A:the phylogenetic tree of BnKNOX proteins;B:the conserved motifs of KNOX proteins,Motif 115 in different colored blocks represent the motif composition;C:gene structure of BnKNOX genes.UTR:untranslated region;CDS:coding sequence.染色体上的基因。A09 染色体包含的 BnKNOX 数目最多,包括 BnKNAT20/25/32 和 BnSTM1;而 A04、A05、A07、A10 和 C06 染色体上均没有 BnKNOX基因。基因复制现象在植物进化中普遍存在,并起着不可或缺的作用42。本研究对 36 个 BnKNOX 基因的复制类型进行分析发现,其中 28 个基因源自全基因组复制或片段复制,其余 8 个基因来自串联复制事件(附表 1)。此外,对 36 个 BnKNOX 基因进行物种内共线性分析,发现了 33 个共线性基因对(图 4)。为了进一步了解 BnKNOX 基因家族在十字花科中的进化关系,本研究分析了其与白菜型油菜、甘蓝和拟南芥中 KNOX 基因的同源关系。共线性分析表明22、27 和 18 个 BnKNOX 基因分别与 AtKNOX、BrKNOX 和 BoKNOX 存在共线性关系(图 5)。表明基因复制事件在 BnKNOX 基因的扩张中起着重要的作用,其中全基因组复制或片段复制起主要作用。Ka/Ks 可用于计算基因在进化过程中是否受自然选择作用,即 Ka/Ks1 表示存在正选择效应,Ka/Ks=1 为中性选择,Ka/Ks1 表示有纯化选择作用。本研究利用 TBtools 的 Ka/Ks Calculator 对甘蓝型油菜 BnKNOX 进行分析发现,所有基因对的Ka/Ks 均小于 1。表明 BnKNOX 在进化过程中可能经历了严格的纯化选择作用,以确保该基因家族的进化保守性、结构稳定性和功能一致性。2.5 BnKNOX 基因的组织表达分析 基于甘蓝型油菜中不同发育阶段各组织/器官的 RNA-seq 数据,本研究分析了 BnKNOX 基因家族成员的组织表达模式(图 6 和附表 2)。BnKNOX 的表达模式大致可分为 3 种类型:第 1 类是在所有组织中均低表达,如BnKNAT20/21/24/27/28;第2类几乎在所有组织中都高表达,如 BnKNAT7/9/15/17;第 3类是在大多数组织中表达,但在特定组织中高表达,如BnKNAT1/2在 下 胚 轴 和 茎 中 高 表 达,BnKNAT25/26/29/30 在胚乳和种子发育过程中高表达,BnKNAT31/32/34 在成熟种子中高表达。此外,II类 BnKNOX 基因的表达水平普遍高于 I 类 BnKNOX基因,表明 II 类中的基因可能对油菜的生长发育更为重要。2.6 BnKNOX 基因的启动子顺式作用元件分析 顺式作用元件在调节基因表达中起着重要作用,具有相似功能的基因可能在启动子中包含相同的调节元件43-44。BnKNOX 基因的启动子区域存在 4 种类型的顺式作用元件,包括与植物生长发育、非生 2998 作 物 学 报 第 49 卷 图 4 BnKNOX 基因的染色体分布及组内共线性分析 Fig.4 Chromosome distribution and collinearity of BnKNOX genes in Brassica napus (图 5)第11期 陈吴钧等:甘蓝型油菜 BnKNOX 基因家族的鉴定与分析 2999 图 5 甘蓝型油菜与拟南芥、白菜型油菜和甘蓝 KNOX 基因的共线性关系 Fig.5 Collinearity of KNOX genes in