干扰素-α通过PD-1_PD-L1途径减轻HBV感染引起的肝组织损伤和肝纤维化.pdf

中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期:./.基金项目:河南省医学科技攻关计划联合共建(.)干扰素 通过/途径减轻 感染引起的肝组织损伤和肝纤维化闪海霞 吴玉卓 颜成果 夏盼盼 李延玲 高 星 范崇桂.南阳市中心医院感染性疾病科(河南 南阳).南阳市中心医院超声科.南阳市中心医院神经内科摘 要 目的:探讨干扰素()对乙型肝炎病毒()感染引起的肝组织损伤和肝纤维化的作用及机制 方法:将/小鼠随机分为对照组、模型组与 组每组小鼠各 只 经尾静脉高压快速注射/.制备 感染小鼠模型 组小鼠在此基础上注射.于模型构建 周后观察小鼠一般情况 法测定 血清学指标、肝功能指标及 水平 技术测定血清 复制水平 染色法观察肝组织形态学改变 染色观察肝组织纤维化程度免疫组化染色法、蛋白免疫印迹法及 技术测定肝组织 和 表达 结果:与模型组比较 组小鼠肝细胞损伤明显减轻仅有少量炎症浸润肝组织内纤维化染色减少 组小鼠血清乙型肝炎 抗原()、乙型肝炎表面抗原()及 水平均显著低于模型组(.)模型组小鼠血清谷草转氨酶()和谷丙转氨酶()水平显著高于对照组小鼠(.)组小鼠血清 水平显著高于模型组 和 水平显著低于模型组(.)模型组小鼠肝组织内 和 蛋白及 水平显著高于对照组小鼠 组小鼠上述指标水平则显著低于模型组小鼠(.)结论:可减轻 引起的肝组织损伤和肝纤维化其机制可能通过/途径阻止 链延伸进而终止病毒复制关键词 乙型肝炎病毒干扰素肝功能肝纤维化/中图分类号 文献标志码 /.().:()().:/./.:.()()(.).()()(.).(.).中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期 (.).:/.:/乙型肝炎病毒()是引起乙型肝炎()最主要病原体类型 我国是 高发地区全球约/的 携带者在中国 的高发病率和致死率使得该病成为威胁我国居民生命健康和生活质量的重要疾病 是一种嗜肝性病毒尽管 患者接受了抗病毒治疗但仍有部分可出现肝纤维化进展 干扰素()不仅具有广谱抗病毒作用还有免疫调节作用 近来研究发现 可能具有抗肝纤维化改善肝功能的作用 程序性死亡受体()/程序性死亡配体()通路是 感染及其相关肝病进展关键机制之一亦是目前 免疫治疗的重要靶点途径 本研究制备了 感染小鼠模型并以.上调体内 水平以探讨 对 感染引起的肝组织损伤和肝纤维化的作用及机制 现将结果报道如下 材料与方法.实验动物/小鼠 只雌性 级周龄 周平均(.)周体质量 平均(.)购自山东博安生物技术股份有限公司(鲁)自由饮食 单笼喂养 温 度 湿 度.主要试剂与仪器/.质粒:中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心.及 质粒:德国埃森医院病毒研究所 无菌 溶液、试剂盒:武汉博士德生物 小鼠 试剂盒、小鼠 试剂盒、试剂盒、通用 试剂盒、超敏 化学发光试剂盒:上海恒斐生物 小鼠 试剂盒、小鼠 试剂盒、总蛋白提取试剂盒:江西艾博因生物 血清总 提取试剂盒、逆转录试剂盒、染色试剂盒:北京百奥莱博 抗体、抗体:美国 全波长酶标仪、微量紫外分光光度计:美国赛默飞世尔 型 仪:美国.分组、模型构建及干预参考文献将/小鼠随机分为对照组、模型组、组每组各 只 模型组和 组 小 鼠 经 尾 静 脉 高 压 快 速 注 射/.注射总量为小鼠体质量的 对照组小鼠经尾静脉注射等剂量 溶液后 组小鼠经尾静脉高压注射.注射总量为小鼠体质量的 模型 组 则 注 射 等 剂 量 周 后 进 行 指 标观察.取材.血清样本于模型构建 周后经小鼠眼眶取血 /离心 取血清 保存备用.肝脏组织颈椎脱臼法处死小鼠消毒腹部打开腹腔暴露肝脏取出肝脏组织.氯化钠溶液冲洗滤纸擦除残留水分多聚甲醛固定 保持备用.观察指标及检测方法.一般情况记录各组小鼠进食量、饮水量、毛发色泽及行为表现.酶联免疫吸附法()法测定 血清病毒学指标、肝功能指标及 水平其中 血清学指标包括乙型肝炎 抗原()、乙型肝炎表面抗原()肝功能指标包括:天门冬氨酸氨基转移酶()、丙氨酸氨基转移酶()取血清样本 溶液以 比例稀释按照试剂盒说明书操作.实时荧光定量聚合酶链式反应()技术测定血清 复制水平 提取血清样本总 全波长酶标仪测定 浓度以 为模板按照试剂盒说明书操作将其逆转录为 以 为内参上游引物 下游引物 上游引物 下游引物 反应体系:.、上游和下游引物各.、.、.反应条件:个循环 仪测定 值实验重复 次取平均值.苏木精伊红()染色法 染色法观察肝组织形态学改变 取由 多聚甲醛固定的肝脏组织经不同浓度乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋制备厚.切片后经二甲苯脱蜡不同浓度乙醇水化纯净水冲洗 苏木素染色 水洗 .盐酸酒精分化 磷酸氢二钠溶液反蓝 乙醇和 乙醇各 伊红染色 蒸馏水冲洗脱水、透明中性树胶封片光学显微镜下观察肝组织形态学.染色法 染色观察肝组织纤维化程度取组织石蜡切片经脱蜡、水化后苏木精染核 蒸馏水冲洗 染液染色 冰醋酸浸洗 磷钼酸水溶液分化 苯胺蓝染色 冰醋酸浸洗脱水、透明中性树胶封片光学显微镜下观察染色情况胶原纤维呈蓝色胞质、纤维素、神经胶质呈红色胞核呈黑蓝色中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期.免疫组化染色法免疫组化染色法测定肝组织 和 表达 取组织石蜡切片经脱蜡、水化后滴加 抗体()和 抗体()过夜孵育滴加二抗室温孵育 液显色镜下观察染色情况自来水终止反应苏木精复染脱水、透明中性树胶封片随机选取 个高倍视野观察染色强度和阳性细胞数量根据免疫反应积分评分法两者积分乘积大于 视为阳性.蛋白免疫印迹法()法测定肝组织 和 蛋白表达水平 提取肝组织总蛋白 法进行蛋白定量 管内加入 蛋白上样缓冲液沸水煮沸琼脂糖凝胶电泳收集蛋白样本湿法转至 膜下脱脂奶粉封闭 滴加 抗体、抗体过夜洗膜 次每次 滴加二抗 孵育 洗膜 次每次 显影 软件分析.逆转录聚合酶链式反应()技术测定肝组织 和 相对表达量 法提取肝组织总 逆转录为 以 为内参上游引物 下 游 引 物 上 游 引 物 下游引物 上游引物 下游引物 反应体系:.、上游和下游引物各.、.、.反应条件:预变性 个循环结果采用 法分析实验重复 次取平均值.统计学方法 用 .软件对数据进行统计分析计量资料符合正态分布用()表示两组比较采用独立样本 检验三组比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验 .为差异具有统计学意义 结果.组小鼠一般情况与对照组比较模型组小鼠进食量和饮水量减少毛发色泽变暗活动减少部分出现精神萎靡或腹水与模型组比较 组小鼠进食量和饮水量逐渐恢复正常毛发色泽较前改善精神状态亦变好无明显腹水.组小鼠肝组织病理学形态及纤维化情况 对照组小鼠肝细胞形态完整肝小叶结构完整肝组织内未发现纤维化染色 与对照组比较模型组小鼠肝细胞排列异常出现假肝小叶细胞内大量炎症浸润且肝组织内有大量蓝色或灰蓝色胶原纤维染色与模型组比较 组小鼠肝细胞损伤明显减轻仅有少量炎症浸润肝组织内纤维化染色减少 图、图 各组小鼠肝组织病理学形态比较(染色)图 各组小鼠肝组织病理肝纤维情况比较(染色).组小鼠 血清学病毒指标及 复制水平 组小鼠血清、及 水平均显著低于模型组(.)表 各组小鼠 血清学指标及 复制水平()组别(/)(/)(/)对照组()模型组().组().与模型组相比.组小鼠肝功能指标及 表达水平模型组小鼠血清 和 水平显著高于对照组(.)组小鼠血清 水平显著高于模型组 和 水平显著低于模型组(.)表 表 各组小鼠、和 表达情况比较()组别(/)(/)(/)对照组().模型组().组().与模型组比较.与对照组比较.组小鼠肝组织 和 表达免疫组化染色显示对照组小鼠肝组织内 和 表达均呈阴性模型组小鼠肝组织内可见大量阳性染色细胞 组小鼠肝组织内 和 阳性染色细胞明显减少图 和 显示模型组小鼠肝组织内 和 蛋白及 水平显著高于对照组 组上述指标水平则显著低于模型组(.)见图 图 各组小鼠肝组织 和 表达情况比较(免疫组化)中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期图 各组小鼠肝组织内 和 及蛋白表达水平与模型组比较.与对照组比较.讨论 感染是各种肝病的重要发病原因我国现存 感染者约有 万例占全球/发病人数 抗病毒治疗是清除 促进疾病转归的主要手段 但临床实践发现传统抗病毒治疗后仍有相当一部分 感染患者有明显肝脏炎症和肝纤维化改变疗效欠佳 研究表明 持续感染是肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的危险因素 如何降低 复制水平逆转肝纤维化进程促进肝功能恢复是临床医生关注焦点本研究经小鼠尾静脉高压注射/.制备 感染小鼠模型 染色和 染色分别观察肝组织形态学及纤维化改变发现与对照组比较模型组小鼠肝细胞排列异常出现假肝小叶细胞内大量炎症浸润且肝组织内有大量蓝色或灰蓝色胶原纤维染色且在肝功能指标上模型组小鼠血清 和 水平显著高于对照组提示 感染可引起肝脏病理学及纤维化改变进而影响肝功能 另外测定血清 血清学和肝功能指标发现对照组小鼠血清、及 阴 性 模 型 组 小 鼠 血 清 中 可 检 测 出、及 以上结果提示 感染小鼠模型构建成功干扰素一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多功能糖蛋白 既往研究多聚焦于 在 感染中的作用发现 可通过增强 复制水平参与慢性乙型肝炎发病过程 与 不同的是 是聚集在 号染色体的型干扰素几乎所有有核细胞均能在感染时分泌 为 亚型之一 已有研究发现 可促进血清 和 转阴具有一定抗病毒效果 且有报道称 可有效阻滞促炎因子生成低肝纤维化小鼠体内炎症反应水平同时通过调控相关通路信号传导抑制肝纤维化形成 本 研 究 经 感 染 小 鼠 尾 静 脉 高 压 注 射.发现小鼠血清 水平显著升高且与模型组比较差异具有统计学意义提示 上调模型构建成功 通过与模型组比较发现上调 表达后 感染小鼠肝细胞损伤明显减轻炎症浸润和肝纤维化改变减少 和 水平显著降低提示 可减轻 引起的肝组织损伤和肝纤维化 同时在分析 对 复制和抗原表达影响发现 组小鼠血清、及 水平均显著低于模型组进一步证实了 抗 作用符合以往研究结果 研究表明 及其配体 的上调在如 等病毒感染过程中有着重要作用 有报道称阻断/途径可达到较高的 病毒应答率并有抗肝纤维化作用 本研究结果显示模型组小鼠肝组织内 和 蛋白及 水平显著高于对照组表明/途径的激活参与 感染符合以往研究结果通过上调 水平发现小鼠肝组织内 和 蛋白及 水平显著降低提示 减轻 引起的肝组织损伤和肝纤维化的机制可能与阻断/途径有关这一结果为 感染治疗提供了更多选择综上所述 可减轻 引起的肝组织损伤和肝纤维化其机制可能通过/途径阻止 链延伸进而终止病毒复制参考文献 刘勇.乙型肝炎病毒感染检测研究进展.中国医疗器械信息():.缪宁王富珍郑徽等.中国 年乙型肝炎发病情况估算和病例特征分析.中华流行病学杂志():.():.():.黄大伟陆定波江诗怡等.补肾生髓成肝方加减联合聚乙二醇干扰素 治疗慢性乙型肝炎的效果及对患者肝功能及肝纤维化的影响.中国医药导报():.():.陈杰.干扰素 通过调节/通路对乙型肝炎病毒感染动物模型肝功能及 蛋白的影响.中国药物与临床():.():.():.(下转第 页)中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期 /.:.:.():./.():./.()():.:.:.():./.:.符泰胜刘春勇.通过 上调 影响骨肉瘤发生发展的机制研究.河北医药():.():.():.刘晨霞常凯那琬琳等.靶蛋白差异表达及调控机制在肝癌复发中的作用.临床肝胆病杂志():.引证本文 贺娟熊明月谢喜科等./对 细胞增殖、凋亡及免疫因子的影响.中西医结合肝病杂志():.(修回日期:编辑:朱德香)(上接第 页).:.():.贾红宇刘克洲.慢性 感染免疫耐受期抗病毒治疗有益于预防肝硬化和肝癌的发生.临床肝胆病杂志():.王秋然施佳建陈婉南等.替诺福韦艾拉酚胺抗乙型肝炎病毒治疗疗效的 分析及非劣效性评价.海南医学院学报():.():.():.():.():.王乐钱毅骏.活性维生素 联合 对肝纤维化小鼠肝纤维化程度、及 表达的影响.肝脏():.刘晓倩乔珺张蕾等.干扰素 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