复发性流产患者胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1表达及意义.pdf

1878 四川生理科学杂志 2023,45(10)临床研究 复发性流产患者胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 表达及意义#徐丽伟*张圆圆 康乐 王杉杉 赵青竹（河南大学第一附属医院妇科，河南 开封 475100）摘要 目的：分析复发性流产（Recurrent spontaneous abortion，RSA）患者胎盘绒毛滋养细胞微管相关蛋白轻链 3（Light chain，LC3）、自噬相关蛋白 Beclin-1 表达及意义。方法：回顾性分析 2021 年 1 月至 2021 年 12月河南大学第一附属医院收治的 50 例 RSA 患者及 50 例胚胎发育正常行人工流产者的临床资料，将 RSA 患者纳入 RSA 组，将人工流产者纳入人工流产组，清宫术后采集其胎盘绒毛滋养细胞使用免疫印迹法检测胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 相对表达量水平，使用 Spearman 分析模型分析胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与复发性流产的相关性，使用受试者工作曲线（Receiver operator characteristic，ROC）计算胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 预测复发性流产发生的预测价值。结果：RSA 组患者胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平显著高于人工流产组（P0.05）；经 Spearman 分析模型分析，胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与 RSA 发生呈正相关（P0.05）。ROC 曲线中，胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平预测 RSA 发生的曲线下面积（Area under the curve，AUC）分别为 0.862、0.862，截断值分别为 1.29、1.43；联合预测的AUC 为 0.942，敏感度为 92.00%，特异度为 86.00%。结论：胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与 RSA发生存在明显相关性，检测胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平预测 RSA 发生具有较高预测价值，为临床治疗提供方向。关键词：复发性流产；胎盘绒毛滋养细胞；微管相关蛋白轻链 3；Beclin-1 复发性流产（Recurrent spontaneous abortion，RSA）指连续发生率两次及以上自然流产，其发生原因较复杂，可能与免疫、内分泌、遗传等因素有关，RSA对孕妇生理及心理均造成较大影响，临床需根据 RSA 患者情况准确判断其 RSA 发生原因并及时采取应对、治疗措施，降低流产风险，预防患者再次流产。胎盘绒毛滋养细胞在胚泡侵袭子宫内膜、胎盘形成及孕期内分泌等存在重要作用，胎盘绒毛滋养细胞凋亡与胎盘生长发育密切相关。自噬为真核细胞基础代谢反应之一，可维持细胞动态稳定，辅助物质、能量再利用，参与妊娠各个时期的生理及病理过程，正常自噬对妊娠存在促进作用，但自噬过度会破坏细胞稳定，导致胎盘组织细胞、内皮细胞等损伤甚至凋亡，引发胚胎死亡及流产。胎盘绒毛滋养细胞微管相关蛋白轻链 3（Light chain，LC3）能靶向定位于自噬体膜，参与自噬过程。自噬相关蛋白 Beclin-1 为自噬体形成的必须分子之一，监测胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1水平可反应胎盘绒毛滋养细胞自噬水平。目前临床大多研究胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与子痫前期的关系。因此，本次旨在分析 RSA 患者胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1表达及其意义，为临床防治 RSA、降低流产率提#基金项目：开封市科技发展计划项目（编号：2106003）；*作者简介：徐丽伟，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤研究，Email：；通讯作者：张圆圆，女，副主任医师，主要从事妇科肿瘤研究，Email：。供参考。1 资料与方法资料与方法 1.1 一般资料 回顾性分析 2021 年 1 月至 2021 年 12 月河南大学第一附属医院收治的 50 例 RSA 患者及 50例胚胎发育正常行人工流产者的临床资料。将RSA 患者纳入 RSA 组，将人工流产者纳入人工流产组。纳入标准：RSA 组患者均符合 RSA 诊断标准1；月经正常，无肿瘤、畸形等生殖系统疾病；无糖尿病等内分泌疾病；夫妻双方染色体均正常；人工流产组均有正常妊娠、分娩史。排除标准：存在明确环境、遗传因素导致流产；人工流产组存在不良妊娠、分娩史；高龄产妇。RSA组中年龄2231 岁，平均26.522.33 岁；流产次数 24 次，平均 3.120.46 次；早期流产29 例，晚期流产 21 例。人工流产组中年龄 2133 岁，平均 26.892.41 岁；妊娠次数 24 次，平均3.080.42 次；分娩次数 13 次，平均 1.970.43 次。本次研究经我院医学伦理委员会审核批准。1.2 方法 1.2.1 样本采集 RSA组及人工流产组均在其清宫术后采集其 四川生理科学杂志 2023,45(10)1879 胎盘绒毛滋养细胞，并使用等渗生理盐水漂洗其中血液，漂洗后放在冻存管内，放入-80 环境下保存。1.2.2 胎盘绒毛滋养细胞 LC3 检测 取出冻存的绒毛组织，加入细胞裂解液，在4条件下以 10000 rmin-1转速离心 10 min，取30 L 上层清液使用考马斯亮蓝法调整蛋白浓度，依次使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转膜至聚偏二氟乙烯膜、5%脱脂奶粉封闭 1 h后，分别加入鼠抗人 LC3、LC3一抗，在 4 条件下放置过夜，然后使用缓冲盐水和洗涤剂洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下放置 1 h，再次洗涤，洗涤后使用增强化学发光法试剂盒进行显影、定影，使用以色列 DNR 成像系统仪器分析蛋白条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，以 LC3/LC3为 LC3 相对表达量。1.2.3 胎盘绒毛滋养细胞 Beclin-1 水平检测 检测方法同胎盘绒毛滋养细胞 Beclin-1 水平检测，测定其蛋白相对表达量。1.3 统计学方法 所有数据采用 SPSS 22.0 进行统计分析，计量资料以均数标准差（XSD）表示，进行 t 检验；计数资料以例或率（n（%）表示，进行卡方检验；P0.05 为差异有统计学意义。以 Spearman分析模型分析相关性。组别赋值“RSA 组”=1、“人工流产组”=0，计入二元 Logistic 回归模型，以胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平为协变量，得出预测概率，以预测概率为联合预测评估预测效能；将胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平及联合预测录入，绘制受试者工作曲线（Receiver operator characteristic，ROC），读取曲线下面积（Area under the curve，AUC）、置 信 区 间（Confidence interval，95%CI）、敏感度、特异度、截断值。2 结果结果 2.1 胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平 RSA 组患者胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平显著高于人工流产组（P0.05），见图 1、表 1。2.2 胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与 RSA发生的相关性分析 经 Spearman 分析模型分析，胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平与 RSA 发生呈正相关（r=0.783，P=0.003；r=0.825，P=0.002）。2.3 胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平预测RSA 发生的预测价值分析 ROC曲线中，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平预测RSA发生的AUC分别为0.862、0.862，截断值分别为 1.29、1.43；联合预测的 AUC 为0.942，敏感度为 92.00%，特异度为 86.00%，见图 2、表 2。图图 1 胎盘绒毛滋养细胞胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平水平 注：左侧为正常妊娠组；右侧为 RSA 组 表表 1 1 胎盘绒毛滋养细胞胎盘绒毛滋养细胞 LC3LC3、BeclinBeclin-1 1 水平比较水平比较（SDSD，n n=50=50）组别 LC3 Beclin-1 RSA 组 1.430.31*1.810.43*人工流产组 1.010.28 1.220.40 注：与人工流产组比较，*P0.05。表表 2 2 ROCROC 曲线参数曲线参数 指标 AUC 95%CI 敏感度 特异度 截断值 LC3 0.862 0.779-0.923 76.00%86.00%1.29 Beclin-1 0.862 0.778-0.923 88.00%74.00%1.43 联合预测 0.942 0.877-0.979 92.00%86.00%-1880 四川生理科学杂志 2023,45(10)图图 2 ROC 曲线曲线 3 讨论讨论 RSA 对孕妇身体造成较大伤害，且对孕妇及其家属心理也造成较大心理压力，RSA 发生的影响因素较复杂，临床需判断 RSA 患者流产原因，并及时采取针对性治疗等应对措施，降低流产率，因此需研究影响 RSA 患者流产的影响因素。胎盘生长发育情况直接影响孕妇妊娠，胎盘绒毛滋养细胞是胎盘组织生长发育及妊娠期内分泌的重要作用细胞之一，当胎盘绒毛滋养细胞自噬活性升高，使胎盘绒毛滋养细胞侵袭能力下降，从而导致胎盘着床较浅，引发流产。胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 均为自噬过程重要参与因子，其水平直接影响到自噬活性2。本研究结果显示，RSA 组患者胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平显著高于人工流产组；经Spearman分析模型分析，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1 水平与 RSA 发生呈正相关，提示胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 语 RSA 发生存在明显相关性。究其原因，Beclin-1 蛋白为自噬发生的主要蛋白之一，可调节自噬前体的生成，引导其他相关蛋白转移至自噬体膜，并平衡胎盘绒毛滋养细胞自噬和凋亡3。LC3 为自噬双膜蛋白，在前自噬泡、自噬泡膜表面均有存在，参与自噬体形成、生长过程，可反映自噬程度4。当胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平上升时，表示自噬程度升高，一方面过量自噬可能直接导致自噬性细胞死亡，另一方面过量自噬可降解生存素等抗凋亡因子的释放，引发胎盘绒毛滋养细胞凋亡，导致胎盘着床浅，孕妇发生流产。并且，本研究通过 ROC 曲线显示，胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平预测 RSA 发生的AUC 分别为 0.862、0.862，截断值分别为 1.29、1.43；联合预测的AUC为0.942，敏感度为92.00%，特异度为 86.00%，说明当孕妇胎盘绒毛滋养细胞LC31.29、胎盘绒毛滋养细胞 Beclin-1 水平1.43 时，孕妇发生流产的风险极高。原因在于，当胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平异常升高时，发生病理性细胞凋亡，引起内皮细胞损伤，导致胎盘发育障碍以及内分泌等功能异常，引发流产5。因此临床可将胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1 水平纳入筛选 RSA 早期诊断的靶向目标，及时采取针对性治疗措施，降低流产发生风险。综上所述，胎盘绒毛滋养细胞 LC3、Beclin-1水平与 RSA 发生存在明显相关性，且其用于早期诊断 RSA 发生具有较高预测价值，为临床防治RSA、降低流产率提供方向及参考依据。参考文献参考文献 1 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