上海交大网络课程检验微生物讲义12.doc

第二十章 真菌
一、 教学大纲要求
1、 掌握真菌的定义、主要生物学性状及主要病原性真菌的致病性
2、 了解浅部感染性真菌的种类和基本性状
3、 掌握深部感染真菌和条件致病性真菌的生物学性状和检验技术
二、 教材内容精要
(一)真菌概述
真菌为真核细胞型微生物，不含叶绿素，无根、茎、叶的分化。具有细胞核和较为完善的细胞器。细胞壁含有几丁质和β葡聚糖。
真菌种类繁多，约10万多种。仅300余种对人类致病。近年来真菌感染有所增加，与AIDS流行、肿瘤和慢性消耗性疾病等导致人群免疫力下降、抗生素滥用引起菌群失调等有关。
单细胞真菌又称酵母菌,呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖。有酵母菌和类酵母菌，在固体培养基上生长的菌落与细菌菌落相似。临床常见的有隐球菌和假丝酵母菌。
多细胞真菌由菌丝和孢子交织组成，称为丝状菌或霉菌。孢子在适宜条件下发芽伸长成芽管，逐进延长呈丝状，称为菌丝。菌丝分枝交织成团形成菌丝体。有的菌丝向上生长，称为气生菌丝；有的伸入培养基中称为营养菌丝；能产生孢子的称为生殖菌丝。有的菌丝内可见隔膜，将菌丝分隔成多个细胞，隔膜上有小孔，容许细胞质流通，称为有隔菌丝。大多致病性真菌的菌丝为有隔菌丝。有些菌丝内无隔膜，称为无隔菌丝。无隔菌丝内有多个细胞核。菌丝有多种形态，可以根据不同形态鉴别真菌。孢子是真菌的繁殖结构，可分为有性孢子和无性孢子。大多病原性真菌形成无性孢子，有3种类型：分生孢子、叶状孢子和孢子囊孢子。
有些真菌在不同的环境条件下，两种形态可以互相转换，如组织胞浆菌、孢子丝菌、球孢子菌等在含有动物蛋白的培养基上37℃培养时为酵母菌型，在25℃普通培养基上呈丝状菌。
真菌对干燥、紫外线有较强抵抗力，紫外线须照射30min钟才能杀死。不耐热，60℃1小时即被杀死。对常用消毒剂有较强抵抗力，对2%石炭酸、0.1%升汞、2.5%碘酒较敏感。常用抗细菌的抗生素不敏感，两性霉素B、制霉菌素、克霉唑、酮康唑、伊曲康唑、灰黄霉素等具有抗真菌作用。
近年来，根据卡氏肺囊虫超微结构，其囊壁结构与真菌细胞相似，大多数学者认为应将其归为真菌，并命名为卡氏肺孢菌。
根据致病性真菌的感染部位，通常分为深部或全身性感染真菌、条件致病性（饲机性）真菌、浅部感染性真菌。
（二） 常用真菌实验技术
1.真菌实验的注意事项
（1）真菌的检验操作应在生物安全柜中进行。特别是粗球孢子菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、新型隐球菌等的分离培养和鉴定操作必须在生物安全柜中进行。
（2）每天工作前后应对工作区域进行消毒。
（3）不可试着闻平板上培养物产生的气味。
（4）不可对组织胞浆菌、球孢子菌进行玻片培养，因为其孢子可在空气中散播。
2.标本的染色检查
有些真菌如深部真菌需要染色后更清楚的观察，常用的染色方法有：
（1）革兰染色法 所有真菌均为革兰阳性，适用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌。
（2）美蓝-伊红或天青-伊红染色法 适用于组织胞浆菌。
（3）乳酸酚棉兰染色法 真菌染成蓝色，适用于所有真菌。
（4）糖原染色 用过碘酸作氧化剂，使真菌胞壁多糖物质被氧化而释放出醛基，与Schiff试剂中的亚硫酸复红及焦亚硫酸钠作用而显示红色。可用于标本直接涂片的染色、组织切片的染色，也可对已进行苏木紫伊红染色的组织切片重染。真菌呈红色，背景淡绿色，细胞核蓝色。糖原、透明质酸、粘蛋白、透明蛋白、血纤维蛋白及胶质颗粒等都呈红色。
（5）嗜银染色法（GMS法） 基本原理与PAS染色法相同，本法用铬酸代替过碘酸。真菌被染呈黑色或黑褐色，菌丝内部为灰紫色，糖原、粘蛋白为淡红色。
（6）粘蛋白-卡红（MCS）法 用于新型隐球菌的鉴别，隐球菌细胞壁和荚膜染成红色，细胞核黑色，背景黄色。孢子丝菌和鼻孢子菌的胞壁也被染成红色。
（7）荧光染色 用0.1%吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌红黄色，曲霉菌为绿色。
3.真菌的分离培养
（1）培养基 真菌的营养要求不高，最适pH4.0~6.0。在一般细菌培养基上即可生长。在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以沙保弱（sabouraud）培养基为基准，描写菌落的形态。常用的培养基有无选择性、选择性和鉴别培养基。无选择性培养基有：沙保弱培养基、脑心浸液培养基和血琼脂培养基。
选择性培养基是在无选择性培养基中根据细菌污染情况加入氯霉素0.05mg/ml和庆大霉素50~100mg/ml或青霉素20U/ml和链霉素40U/ml或金霉素100mg/ml和庆大霉素100mg/ml或氯霉素16mg/ml和庆大霉素4mg/ml等以抑制细菌的生长。为抑制腐生性真菌的生长，加入0.5mg/ml放线菌酮，但对新型隐球菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌及曲菌有抑制作用。
鉴别培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂、酵母浸膏琼脂、米粉琼脂、蔡氏琼脂等。
（2）培养方法 试管培养法、大培养法和小培养法。
4.培养结果的观察 真菌生长后主要观察菌落的以下方面：
生长速度、菌落大小、表面形态、菌落颜色、菌落边缘、菌落底部。
菌落性质：可分为酵母型、酵母样型和丝状菌落。酵母型菌落外观光滑、质地柔软、呈乳酪样，与细菌菌落相似如隐球菌。酵母样型菌落与酵母型菌落相似，但形成假菌丝，伸入培养基中，如假丝酵母菌。丝状菌落是多细胞真菌的菌落形态，呈棉絮状、绒毛状或粉末状，根据菌种的不同，菌落形态多变，是鉴定的重要依据。
5.其他鉴定诊断技术
（1）动物接种 动物接种可以有效的分离病原性真菌，确定真菌的致病性。常用小白鼠接种新型隐球菌、孢子丝菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌较敏感。巴西芽生菌、球孢子菌应接种豚鼠睾丸内。白假丝酵母菌、皮肤丝状菌对家兔比较敏感。
（2）病理组织检查 病理组织检查是诊断深部真菌病的重要方法。用真菌染色后在组织内发现孢子或菌丝则具有诊断意义。
（3）免疫学检查 真菌感染的诊断，主要取决于病原学诊断。但在某些情况不能获得病原学证据，如急性组织胞浆菌病、曲霉型支气管炎等，需要依靠免疫学手段进行辅助诊断。与其它微生物相比，真菌产生的抗体慢而滴度低，变态反应严重。免疫血方法有皮肤试验和用胶乳凝集试验、酶联免疫试验、补体结合试验、荧光抗体试验、放射免疫试验测定血清中相应抗体的水平
4.核酸检测：应用分子生物学技术，如DNA探针杂交、PCR技术检测组织标本中的真菌DNA进行诊断，正在不断研究和试验中。
（二） 浅部感染性真菌
浅部感染性真菌包括皮肤表面感染性真菌、皮肤癣真菌和皮下组织感染性真菌。
我国主要的皮肤表面感染性真菌是糠秕马拉癣菌，主要寄居在人体皮肤和毛干的最表层。是一种嗜脂性酵母样菌，为条件致病菌，可在健康人皮肤上分离到。
皮肤癣菌是寄生于皮肤角蛋白中引起皮肤浅部感染的真菌，又称皮肤丝状菌。仅侵犯角化的皮肤、毛发和指（趾）甲等部位。共有约45种，其中约有20余种对人致病。分为毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子癣菌属。我国以红色毛癣菌为最多，其次为紫色毛癣菌、须毛癣菌、絮状表皮癣菌。
引起皮下组织感染的真菌主要有着色真菌和孢子丝菌。外伤感染后，皮下组织感染性真菌在局部真皮深层、皮下组织生长繁殖，并缓慢向周围组织扩散，还可经淋巴向全身扩散。在我国以卡氏枝孢霉为最多，其次为裴氏着色真菌。孢子丝菌广泛分布于土壤、尘埃、木材上，属于腐生性真菌。常因外伤感染本菌引起孢子丝菌病。主要的感染菌是申克孢子丝菌。
（三）深部感染真菌
1.隐球菌
仅新生隐球菌及其变种有致病性，新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体表、口腔和肠道中。在鸽粪中大量存在，通过吸入鸽粪污染的空气而感染，特别是在一些免疫低下者。
新生隐球菌在组织中呈圆形或卵圆形，直径一般在4~6μm，菌体外有宽厚荚膜，荚膜比菌体大1~3倍，折光性强，一般染色法不易着色。常用墨汁负染色法，在黑色背景下可见透亮菌体，内有一个较大的反光颗粒和数个小的反光颗粒。常见出芽现象，菌体外有透明的宽厚荚膜。经培养后菌体可变小。非致病性隐球菌无荚膜。
新生隐球菌在沙保弱培养基和血平板上，25℃及37℃均能生长，形成白色至奶油色、粘稠酵母型菌落，后转变为橘黄色最后成棕褐色。有的菌落可以液化。能分解尿素。根据新生隐球菌的荚膜多糖分为A、B、C、D等4个血清型，我国临床标本中主要是A型。此外我国还发现了新生隐球菌上海变种。
本菌属外源性感染。经呼吸道侵人人体，由肺经血行播散时可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。新生隐球菌病好发于细胞免疫功能低下者，如 AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者。因此，临床上隐球菌性脑膜炎常在系统性红斑狼疮、白血病、淋巴瘤等病人中发生。在国外已成为AIDS的最常见的并发症，是AIDS死亡的首要原因。
用病人脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速的方法，可见透亮菌体，内有一个较大的反光颗粒和数个小的反光颗粒及出芽现象，菌体外有透明的宽厚荚膜。常规细胞染色可发现隐球菌，如用PAS染色后新生隐球菌呈红色。用氢氧化钾涂片可见发芽的菌体，不能看见荚膜，须与淋巴细胞、脓细胞等鉴别。
用乳胶凝集试验、ELISA和单克隆抗体法等免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床的常规诊断方法，其中以乳胶凝集试验最为常用。
将标本接种在沙保弱培养基，病原性隐球菌在25℃和37℃孵育均可生长，而非病原性隐球菌在37℃时不生长。培养2~5d后观察菌落形态特点，并取菌落作墨汁负染色镜检。
新生隐球菌酚氧化酶阳性，脲酶试验阳性，能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能发酵糖类、不同化硝酸盐。非致病性隐球菌则不能同化肌醇。
新生隐球菌对小鼠接种敏感，注入腹腔、脑或静脉内，小鼠在1~3周内死亡。
2.二相性真菌
组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌以及副球孢子菌均属二相性真菌，在体内或37℃培养时呈酵母型，在室温下或人工培养时变为丝状型。
（四）条件致病性真菌
条件致病性真菌致病性不强，大多发生在机体免疫力低下或菌群失调时，如肿瘤、慢性消耗性疾病、器官移植后、HIV患者、长期使用广谱抗生素、正在接受放疗或化疗的患者容易发生感染。通常为内源性感染。常见的菌株有假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌和卡氏肺孢子菌。
1.假丝酵母菌
俗称念珠菌。本属菌有81个种，其中11种对人致病。白假丝酵母菌为最常见的致病菌，其次为热带假丝酵母菌，克柔假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌也较常见。
白假丝酵母菌呈圆形或卵圆形。直径3~6μm。革兰阳性。出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝，在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。
取标本直接涂片，革兰染色后镜检，见到革兰阳性（着色不均匀）、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。取病人血清作ELISA、免疫印迹法等检测白假丝酵母菌抗原。
将标本接种在沙保弱培养基上，25℃或37℃培养l~4d后，培养基表面可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。此外，还可作以下试验加以鉴定：
l）芽管形成试验：白假丝酵母菌可形成芽管，但并非所有的白假丝酵母菌都形成芽管，其它假丝酵母菌一般不形成芽管。
2）厚膜孢子形成试验：将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基，仅白假丝酵母菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。
3）糖同化或发酵试验：不同的假丝酵母菌对糖类的发酵和同化能力是不同的。常用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖进行发酵试验，用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖进行同化试验。
5）动物试验：将假丝酵母菌悬液注射 lml于家兔耳静脉或注射 0.2ml于小白鼠尾静脉，观察5~7d，注意动物是否死亡。剖检时如发现脏器有多种小脓肿，即为白假丝酵母菌感染，其他假丝酵母菌对动物无致病性。
2.曲霉
曲霉广泛分布于自然界。曲霉有900余种，对人致病的曲霉至少有10种，其中最常见的约有8种。
曲霉是条件致病菌，在人体免疫功能降低时致病，如长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素，放疗、化疗，各种恶性肿瘤、糖尿病、AIDS等可诱发曲霉病。曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，全身性曲霉病有增高的趋势。曲霉除直接感染和产生变态反应引起曲霉病外，可产生毒素引起食物中毒，黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作用，黄曲霉毒素可能与人类原发性肝癌的发生有关。
取标本涂于载玻片上，在镜下可见分枝的菌丝、较粗的分生孢子头，顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小梗，小梗上有许多小分生孢子的特征性结构。
分离培养与鉴定 标本接种沙保弱琼脂，室温培养后形成黄绿色毛状菌落。涂片镜检可见特征性的分生孢子头和足细胞。根据不同的形态和菌落特征确定菌种。
免疫学检测：用竞争性ELISA测定病人血清中曲霉抗原。常用免疫扩散、对流免疫电泳、ELISA、生物素一亲和素酶联免疫吸附测定、放射免疫测定（RIA）及间接免疫荧光法等检测病人血清中抗曲霉抗体。菌丝和培养滤液可作ELISA抗原。
3.毛霉目真菌
毛霉目真菌有7个科，主要是毛霉科。毛霉科中的根霉属、梨头霉属、毛霉属、根毛霉属常引起毛霉病，其中根霉属中的少根根霉和米根霉两种最多见。
免疫功能低下者如AIDS、慢性消耗性疾病如糖尿病、白血病等肿瘤患者长期应用化疗、器官移植和自身免疫性疾病患者长期应用免疫抑制剂和皮质类固醇激素最易感染。该病起初多发于鼻粘膜或鼻窦，继而扩展则眼眶软组织、面腭及脑，还可发生于肺部、胃肠道、皮肤等处，也可全身性播散，临床上常见的是眼眶及中枢神经系统的毛霉病，死亡率高。
4.卡氏肺孢菌
卡氏肺孢菌，曾称为卡氏肺孢子虫。可引起间质浆细胞性肺炎，近年以来卡氏肺孢菌肺炎已成为AIDS患者最常见的机会性感染，并是其致死的的主要原因。
卡氏肺孢菌生活史有包囊和滋养体两种形态。包囊为感染型，分为成熟包囊和未成熟包囊。前者包囊壁较厚，直径6~8μm，呈球形、圆形、椭圆形、瓢形，包囊内含8个囊内小体，大小l~ 1.5μm，呈球形、半月形或阿米巴形，排列呈玫瑰花状或不规则形，单个核；后者大多为椭圆形，3~5μm，囊内核l~8个。滋养体为繁殖型，壁较薄，单个核，形态不规则，直径2~5μm，姬氏染色后胞质呈蓝色，核呈紫红色。呈二分裂法繁殖。
长期使用免疫抑制剂、器官移植、肿瘤、艾滋病等引起宿主免疫力下降，潜伏的卡氏肺孢菌在患者肺内大量繁殖扩散，使肺泡上皮细胞受损，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌性肺炎。卡氏肺孢菌病是AIDS最常见、最严重的机会感染性疾病。
将痰液或气管抽吸物涂片后用姬姆萨染色，在显微镜下可见包囊内的8个囊内小体，囊内小体的胞质呈浅蓝色，核1个呈紫红色。用IFA、ELISA、CFT检测人群血清中卡氏肺孢菌抗体，可用于流行病学调查。
（五）真菌体外药物敏感试验
1.常量稀释法
肉汤常量稀释法是广泛适用于抗真菌药敏试验的方法，适用于所有抗真菌药物对所有真菌的测试。
培养基 无碳酸盐的RPMI1640加L-谷氨酰胺和pH指示剂。25℃用MOPS调节培养基的pH至 7.0。适合5-FC和砒咯类抗假丝酵母菌和一些丝状菌的药敏试验。
药物原液 抗真菌药物的标准品能从药品的鉴定机构和生产厂商处获得。静脉注射和口服制剂不能用于药敏试验。抗菌药物的贮存液必须高于试验浓度的10倍（如氟康唑和5-FC为1280μg/ml）。5-FC、氟康唑和其它任何水溶性的药物应用蒸馏水配成水溶液。对于多烯类或其它水溶性的药物，称取足够量的标准品用二甲亚砜、聚乙二醇等制成1600μg/ml的溶液。二性霉素B应避光。
无菌的贮存液应分装成小容量。在-60℃或以下贮存6个月，但在-20℃或以上将会失活。根据需要在使用当天取出。取出后未经使用的溶液应全被废弃。
接种菌液的制备 测试菌株接种在沙保弱培养基35℃培养至少传代二次。将培养24小时后的假丝酵母菌和培养48小时以上的新型隐球菌挑选直径1mm以上的菌落5个。混悬在无菌的5ml 0.85%Nacl中。在530nm下测量浊度，用无菌生理盐水调节浊度至0.5麦氏标准。悬液的菌数为1×106至5×106CFU/ml。
常量测试的药物稀释 对非水溶性的药物如二性霉素B、酮康唑、伊曲康唑及其它药物的稀释，是从比使用浓度高100倍的贮存液用100%溶解的溶剂进行稀释。水溶性药物（如氟康唑）从贮存液中直接用RPMI培养基倍比稀释至最终浓度的10倍（如氟康唑和5-FC为 640~1.2μg/ml）。
MIC测定管在35℃无振摇孵育，假丝酵母菌46~50h，新型隐球菌70~74h。细菌混浊或生长根据其生长情况分级。对二性霉素B而言，MIC被定义为能抑制任何可见生长的最低浓度。对唑类药物和5-FC，，与生长对照相比减少80%生长相关的最低浓度为MIC终点。
质控 根据NCCLS的指南，将近平滑假丝酵母菌ATCC22019和克柔假丝酵母菌ATCC6258作为质控菌株。
2.微量稀释法
10倍和100倍的药物稀释方法同常量法，各自用RPMI培养基进行1：5和1：50稀释。最终提供2倍浓度的药物稀释液。菌株接种物悬液的制备如常量法，酵母菌的悬液用旋涡混合仪混匀15秒，然后1：50稀释，再进一步1：20稀释以获得2倍浓度测试悬液（细胞含量1×103至5×103cfu/ml）。最终测试菌株浓度为0.5×103至2.5×103cfu/ml。
肉汤微量稀释法用无菌的可任意组装的多孔微稀释板进行（96孔U形板），质控菌株同时同法检测，设一列无菌试验对照。
微量稀释法在35℃孵育，观察有无肉眼可见的生长。每孔与生长对照孔比较。二性霉素B的MIC被定义为完全抑制生长的完全透明的最低药物浓度。5-FC和咪唑类的MIC被定义为与生长对照比较50%生长被抑制的最低药物浓度。微孔条的摇动更有利于对显著生长抑制的观察。
改良方法包括色度法、光谱法及E试验等。