真核生物蛋白质生物合成的起始.doc

真核生物蛋白质生物合成的起始自八十年代以来，人们对真核细胞蛋白质生物合成及其起始因子的研究有了进一步深入。elF的作用或真核细胞蛋白质合成的起始过程与原核细胞的起始过程大体类似，不同之处主要有以下几点：(1)特异的起始型tRNA为Met-tRNAMet，不需要N末端的甲酰化。(2)Met-tRNAMet和GTP与eIF2形成一个可分离的复合物，不依赖于小亚基。而在原核细胞IF1与tRNAMet结合在30S小亚基上。(3)tRNA Met与40S小亚基的结合先于与mRNA的结合。相反，在原核细胞tRNAMet与30S小亚基的结合后于mRNA与30S小亚基的结合。(4)ATP水解为ADP提供能量，对于mRNA的结合是必需的。(5)在真核细胞，不仅elF的种类多，而且许多elF本身是多亚基的蛋白质。最明显的是elF3(涉及mRNA结合，类似于原核细胞IF3的作用)，含有大约10个亚基，分子量达106KD，其重量相当于40S亚基重量的1/3。(6)mRNA5端帽的存在对于起始是需要的(除外某些病毒mRNA，一些病毒mRNA的5末端有共价结合的蛋白质)。(7)真核细胞在起始过程中存在的一种蛋白质合成调节方式是最后一个关键差别。elF，每个循环周期经历一次GTP-GDP交换，参与该交换过程的另一蛋白质称为elF2B(也称为GEF，即GTP-GDP exchange factor)。从酶催化上讲，过程类似于原核细胞肽链延长中的EF-Tu/Ts循环(见第二节)。当elF2将Met-tRNAMet定位于核糖体后它即转变为无活性形式的elF2-GDP。只有当elF2与elF2B形成复合物(elF2-elF2B)后，elF2中的GDP才能被取代。在elF2-elF2B复合物中。elF2与GTP有很高的亲和力，因此能再进入活性状态并再与Met-tRNAMet结合。在这个循环过程中，elF2的三个亚基之一elF2对磷酸化敏感。磷酸化的elF2与elF2B形成的复合物甚稳定，不易解离，从而降低了elF2的可利用性。真核细胞蛋白质生物合成的起始步骤可概括为：(1)形成43S核糖体复合物;由40S小亚基与elF3和elF4c组成。(2)形成43S前起始复合物:即在43S核糖体复合物上，连接elF2-GTP-Met-tRNAMet复合物。(3)形成43S前起始复合物:由mRNA及帽结合蛋白1(CBP1)、elF4A、elF4B和elF4F共同构成一个mRNA复合物。mRNA复合物与43S前起始复合物作用，形成48S前起始复合物。(4)形成80S起始复合物:在elF5的作用下，48S前起始复合物中的所有elF释放出，并与60S大亚基结合，最终形成80S起始复合物，即40S亚基-mRNA-Met-tRNAMet-60S亚基。在真核生物蛋白质生物合成的起始阶段，值得一提的是40S核糖体亚基几乎总是选择第一个起始密码子AUG，开始对mRNA翻译，这种选择比原核细胞对起始密码子的选择方式更简单些。首先，AUG是唯一的起始密码子，而在原核细胞(E.coli)可作为起始密码子的三联体除AUG外，还有GUG，UUG，甚至AUU也可被利用。其次，定位在mRNA5末端的AUG(通常距5末端10-100个核苷酸)总被选择。其最简单的模式是:40S亚基与带帽的mRNA5末端接触，并沿着mRNA扫描一直到抵达第一个AUG处再开始翻译。该过程需消耗ATP。这主要是由于Met-tRNAMet的反密码子与起始密码子AUG互补的结果。因此正如前述，真核细胞蛋白质生物合成的特点之一是:tRNAMet先与40S亚基结合，然后再与mRNA结合。由此看来，扫描过程其实是以43S前起始复合物的形式进行的。在真核细胞tRNAMet中，毗邻它的反密码子3端的核苷酸是被一个大集团修饰的A(t6A:N-9-D-呋喃核糖)嘌呤-6-氨基甲酰苏氨酸)，t6A能通过加强成摞反应(Stacking interaction)，稳定反密码子3端核苷酸，不允许在密码子与反密码子的反应中密码子第一位碱基摆动。原核细胞tRNAMet缺乏该修饰碱基，因此在反应过程中允许密码子有更多可摆动性。这个结构的存在也有助于解释43S前起始复合物对起始密码子AUG的选择的简单的方式。所以，在真核mRNA中，附加的上游信号是必要的，例如象原核mRNA的SD顺序那样的信号。但是，通过深入研究40S亚基对起始部位的选择机制。发现亦有某些例外情况，即一些mRNA的翻译不是从起始AUG开始，而是从下游AUG处开始开放读框。研究表明，事实A+1NNAUGG顺序对于40S亚基进行起始是理想的序列。如果该顺序-3位的A或G和G+1位的G被取代的话，该起始密码子可能就被漏读，或者40S亚基经过AUG继续扫描下去。 肽链的延长和终止与真核细胞蛋白质生物合成的起始因子相比较，在延长和终止步骤中所涉及的因子就十分简单。真核细胞肽链延长和终止过程所涉及的因子因子功能相应的原核细胞因子EF1促使aa-tRNA与核糖体结合EF-TuEF1使EF1再循环EF-TsEF2转位EF-GRF肽链释放RF1RF2延长因子(EF)，分子量约50KD。EF1可与GTP和aa-tRNA形成复合物，并把aa-tRNA供给核糖体。对EF1的研究不象对原核细胞EF-Ts那么清楚，但已证明EF1能催化GDP-GTP交换，有助于EF1再循环利用，EF2分子量约100KD，相当于原核细胞的EF-G，催化GTP水解和使aa-tRNA从A位转移至P位。肽链合成的终止仅涉及到一种释放因子(RF)，分子量约115KD。它可以识别所有的三种终止密码子UAA，UAG和UGA。RF在活化了肽链酰转移酶释放新生的肽链后，即从核糖体解离，解离过程涉及GTP水解，故终止肽链合成是耗能的。 真核生物蛋白质生物合成的特异抑制剂真核细胞蛋白质生物合成的特异抑制剂的作用环节。 毫不惊奇，一些能够抑制原核细胞蛋白质生物合成的抑制剂同样也能抑制真核细胞的蛋白质生物合成。如aa-tRNA的类似物嘌呤霉素可提前终止肽链翻译。又如梭孢酸(fusidicacid)不仅可阻止完成功能后的原核细胞EF-G从核糖体释放，也能阻止真核细胞EF2的释放。有一些抑制剂对真核细胞的翻译过程是特异的，这主要是由于真核细胞翻译系统装置的特殊性。如7-甲基鸟苷酸(m7Gp)在体外抑制真核细胞的翻译起始，就是因为m7Gp与帽结合蛋白质竞争性地与mRNA5端帽结合。同样，其它多数真核细胞蛋白质生物合成的特异性抑制剂亦可与不同的翻译装置(成份)结合。上述这些特异性抑制剂大多数是小分子，有的是多肽，如蓖麻蛋白(ricin)。蓖麻蛋白是一种特异的核酸酶，能够通过使60S亚基水解失活而中止延长步骤。由白喉杆菌(Coryne bacterium diptheriae)所产生的致死性毒素是研究得较为清楚的真核细胞蛋白质合成抑制剂。白喉毒素是一种65KD的蛋白质，它不是由细菌基因组编码的，而是由一种寄生于白喉杆菌体内的溶源性噬菌体(phage)编码的。该毒素只是经白喉杆菌转运分泌出来，然后进入组织细胞内。一旦进入真核内，白喉毒素就催化ADP-核糖与EF2连接。ADP-核糖由NAD+提供，它与EF2分子中修饰的组氨酸残基结合。在体外，这种结合很容易被加入尼克酰胺而逆转。一旦EF2被ADP-核糖化，EF2就完全失活。由于白喉毒素是起催化作用，因此只需微量(也许少至一个分子)就能有效地抑制细胞的整个蛋白质合成，而导致细胞死亡。EF2中修饰的组氨酸残基亦称为白喉酰胺(diphthamide)。假如在EF2中不存在白喉酰胺，白喉毒素就不会杀死哺乳动物细胞。 蛋白质合成后的分泌不论原核核还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质需定位于细胞的特异区域，或者分泌出细胞。将蛋白质分泌出细胞，在真核细胞比原核细胞更困难，因为真核细胞胞体大，而且还有大量的膜性间隔。一些蛋白质被合成后分泌到细胞外，这些蛋白质统称分泌蛋白。人们发现，将某些分泌蛋白质mRNA在体外进行翻译时，其翻译产物的分子量比预计的要大的多。例如胰岛素由个氨酸残基组成，但胰岛素mRNA的翻译产物在兔网织红细胞无细胞翻译体系中为个氨基酸残基，称为胰岛素原（proinsulin)。在麦胚无细胞翻译系统中为个氨基酸残基组成的前胰岛素原。后来证明，在前胰岛素原的M末端有一段富含疏水氨基酸的肽段作为信号肽（signalpeptide)，使前胰岛素原已成为胰岛素原。然后胰岛素原被运到高尔基复合体，切去C肽成熟的胰岛素，最终排出胞外。后来发现，几乎各种分泌蛋白质（如真核细胞的前清蛋白，免疫球蛋白轻链，催乳素等，原核细胞的脂蛋白、青霉素酶等）均含有信号肽，约由个疏水氨基酸残基构成。近年来，人们才提出了信号肽假说去解释分泌蛋白质的分泌。其机理是:当新生肽链正在跨越膜时，信号序列和其后段折成两个短的螺旋段，并曲成一个反向平行的螺旋发夹，该发夹结构可插入到疏水的脂质双层中。一旦分泌蛋白质的N端锚在膜内，后续合成的其它肽链段部分将顺利通过膜。疏水性信号肽对于新生肽链跨越膜及把它固定在膜上起了一个拐棍作用。信号肽在完成功能后，随即被一种特异的信号肽酶水解。哺乳类动物的信号识别颗粒（SRP)可见蛋白质与折叠的RNA的二个结构域缔合，Alu表示SLRNA的序列(7SLRNA的序列与脊椎动物基因的Alu重复序列家族的的序列同源)。S代表特殊的中心区。真核细胞蛋白质生物合成的特异抑制剂的作用环节。杆形颗粒的长度约相当于核糖体直径。在80年代中期，Walter等人已提出了肯定的证据表明:在启动分泌和控制分泌方面，有一小分子RNA-蛋白质反复合物起关键作用。由于该复合物能与新生的信号肽特异性反应，故被命名为信号识别颗粒(Signal Recognition Particle，简写为SRP)。SRP由7SLRNA(约300个碱基)和6种不同的蛋白质紧密结合组成。蛋白质的分子量从9-72KD不等。SRP的作用是能与核糖体结合并停止蛋白质结合，阻止翻译发生在肽链延长至约70个氨基酸残基长时。这个长度正好是信号肽完全从核糖体出来时的长度(随信号肽后的30-40个氨基酸残基此时被埋在核糖体内)。当SRP)与内质网膜上的船坞蛋白(docking protein)接触后，翻译阻滞逆转，SRP扩散开再去启动另一蛋白质转运。上述SRP对翻译起负调节作用具有极重要的生物学意义。SRP在胞浆内含量很高，约有106个拷贝(约占哺乳动物细胞核糖体数量的1/10)。哺乳动物分泌蛋白质中的许多种都是降解酶类(如核酸酶、蛋白酶等)，即使它们偶然出现在胞浆内也会造成细胞内的大灾难。通过用SRP暂时中止这些蛋白质的翻译，确保这些蛋白质未到达内质网膜之前不能完成翻译。这样，在信号肽和SRP的共同作用下，使得这些分泌蛋白能及时进入膜性腔内，完成转运和分泌。