蛋白组学在肾脏病研究中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白组学在肾脏病研究中的应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科,王伟铭,前言,肾脏病的治疗进展缓慢,细微的组织病理学：早期诊断、预后追踪以及疗效观察,尿液：与泌尿系统之间存在着天然的联系，使得尿液在反映泌尿系统功能方面具有“地理”优势,体外的肾活检,蛋白组学与肾脏,PubMed,：,关键词：,proteomics or proteome or proteomic together with kidney or renal or urine or urinary,2010.11.1,：过去,5,年,1156,篇,解决临床及基础问题的途径,内 容,蛋白组学技术,蛋白组学与肾脏病研究,蛋白质组和蛋白质组学,蛋白质组（,proteome,）：细胞、组织或机体在特定的时间和环境中基因组所动态表达的蛋白质。,蛋白质组学（,Proteomics,）：以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体，并在此基础上对疾病发病机理、预后判断等方面进行探索,从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域,Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins,but also the determination of their localization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,their function.,Nephrol Dial Transplant(2010)25:11,16,研究过程：蛋白质分离、鉴定以及信息资料分析处理三部分,蛋白质组学重要工具,1.,蛋白质的分析分离技术。,2D-SDS-PAGE,：应用最为广泛,1D-SDS-PAGE,高效液相层析（,HPLC,）,等电聚焦（,IEF,）毛细管电泳（,CE,）,离子交换液相层析（,LC,）,反向（,RP,）,-HPLC,串联。,Two-dimensional Gel Electrophoresis,Cut out Spots and Identify Proteins by Tandom Mass Spectroscopy,2.,质谱（,MS,）技术：,蛋白质,肽的精确质量测定,对肽序列进行分析,质谱技术,Mass spectrometry-based proteomic technologies,基质辅助激光解析电离质谱,(MALDI-MS):,利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化,电喷雾电离质谱,(ESI-MS):,在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化,表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（,surface enhanced laser desorption ionization time-of flight mass spectrometry,，,SELDI-TOF-MS,）,通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间,(TOF),即可计算得到准确的肽段质量,质谱技术,Four different types of MS-based proteomic technologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS,Four different types of MS-based proteomic technologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS,不同蛋白质组学技术的比较,技术,优势,局限性,2DE-MS,适合大分子，通过二维斑点可估计实际分子量并进行排序,无法检测分子量,20kD,）,耗时，敏感度与成分有关，检测物分子量范围有限,CE-MS,自动化，敏感度高，省时，样本量小，多维度,不适合于大分子（,20kD,）,多维液相色谱,-,质谱技术,通过,相对和绝对定量的同位素标签试剂（,iTRAQ,）,还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。,ICAT,技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术,(isotope coded affinity tags,ICAT),可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质,质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等,新技术,Agilent HPLC-Chip II,，是高通量、微型化和自动化为特点的蛋白组学检测技术。能同时从微量的样品中检测多种蛋白质或多肽，用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定。,数据分析,data mining,蛋白质组研究中的生物信息学,蛋白质氨基酸序列,(sequence),数据库,蛋白质结构域与家族数据库,蛋白质高级结构及分类数据库,蛋白质,2DE,图谱数据库,蛋白质相互作用数据库,内 容,蛋白组学技术,蛋白组学与肾脏病研究,尿蛋白质组,Davis,和,Spahr,（,2001,）：尿蛋白质组研究的早期开拓者,用,LC-MS/MS,方法分析了酶切后的混合尿样，共鉴定出,124,个蛋白。,Thongboonkerd,（,2002,）：第一张人尿蛋白质组,2D,图,67,种蛋白及它们的异型体,蛋白大部分是尿液中的高丰度蛋白,由病变组织漏出、分泌、裂解而释放出的生物标志物很多都是低丰度蛋白,尿液标本的准备,标本收集,:,空腹晨尿或中段尿,标本处理：蛋白测定,乙醇沉淀,ethanol precipitation,真空浓缩,vacuum centrifugation,微浓缩,microconcentration,反相捕获柱,reverse phase trapping column,标本储存：,70,或,20,稳定性,/,差异性,尿蛋白质组在个体间存在着明显的差异,由于锻炼、饮食、生理节奏等因素的影响，同一个体不同时间段的尿蛋白质组也会发生改变,尿蛋白组随时间发生变化，晨尿较其他时间点包含更多蛋白点,不同天内所得尿蛋白组间较同一天内不同时间点间差异更大,稳定性,/,差异性,个体间较个体内存在更明显的差异,早期小样本试验得到的候选标志物必须经过大样本的验证，才能确定哪些蛋白的变化真正是由疾病导致的，而并非生物学上的变异造成的,糖尿病肾病,Bellei et al.(,2008,),方法：,2DE,和,ESI-Q-TOF MS/MS,2,型糖尿病早期肾脏改变：尿液生物标记物,正常白蛋白尿,(,n,=10),、,2,型糖尿病肾病,(,n,=12),、健康对照,(,n,=12).,11,种差异表达蛋白,3,种蛋白减少：前列腺酸性磷酸酶前体（,prostatic acid phosphatase precursor,）,核酸核酶,激肽释放酶,-3,8,种蛋白进行性增加：,transthyretin precursor,免疫球蛋白,(Ig)C,链,region,Ig V,链,-II region Cum,Ig-V,链,-III region SIE,碳酸酐酶,1,血浆视黄醇结合蛋白,2-,微球蛋白前体,2-,糖蛋白,1.,Proteomics Clin.Appl.,2,(4):478-491.,糖尿病肾病,Lapolla et al.(,2009,),方法：,MALDI-MS,病例：糖尿病、肾病、糖尿病肾病、健康对照,差异蛋白：,1219,1912,和,2049 Da,MALDI-TOF/TOF,：,uromodulin,I,型胶原,1,前体,和,IV,型胶原,-5,链前体,J.Mass Spectrom.,44,(3):419-425.,糖尿病肾病,Wu J,Chen YD,Gu W,（,2008,）,方法：,SELDI-TOF-MS,病例：,106,例正常、微量、大量白蛋白尿,DM,、,50,例健康对照,差异蛋白：,4239.0,4453.5,5281.1,5898.5 Da,特异性：,80%,；敏感性：,75%.,Wu et al./J Zhejiang Univ-Sci B(Biomed&Biotechnol)2010 11(4):227-237,糖尿病肾病,Jiang et al.(,2009a,),方法：,2DE,和,MALDI-TOF/MS,病例：,2,型糖尿病正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和健康对照,差异蛋白：,12,种蛋白,E-cadherin,增加,1.3-,5.2-,8.5,倍,Western blot,：尿标本中表达增加,ELISA,：,sE-cadherin/,肌酐比显著增高,(DN),免疫组化：肾小管上皮细胞,E-cadherin,表达减少,(DN),E-cadherin,可作为糖尿病肾病相关的新的标志物,Diabetes Metab Res Rev 2009;25:232,241.,糖尿病肾病,Jiang et al.,2009b,方法：,2DE,和,MALDI-TOF-MS,目的：监测糖尿病肾病的发生发展,病例：,12,例,DN(1,型和,2,型糖尿病,),、,6,健康对照,差异蛋白：,orosomucoid,验证：,90,例糖尿病患者、,30,例健康对照,尿,orosomucoid,排泄率,(UOER),随白蛋白尿进行性上升,尿,orosomucoid,可作为,DN,的生物标志物,NEPHROLOGY,2009;,14,332,337,2-D gel electrophoresis(2-DE)images of urine samples from diabetic nephropathy(DN)patients and healthy controls.,NEPHROLOGY,2009;,14,332,337,IgA,肾病,Haubitz et al.(,2005,),方法：,CE-MS,差异：正常对照（,57,例）,IgAN,特异性,尿多肽谱,IgAN,（,45,例）：敏感性,100%,、特异性,90%,膜性肾病（,13,例）：敏感性,77%,、特异性,100%,3,种多肽,masses,：,2752.4,2427.1,2057.3 Da,血清白蛋白片段,Kidney Int.,67,(6):2313-2320.,IgA,肾病,Rocchetti et al.(,2008,),方法：,2DE,和,nano-HPLC-ESI-MS/MS,病例：正常对照,20,例、,IgAN R(ACEI)9,例、,IgAN NR 9,例,差异蛋白,:,激肽原,inter-trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor(ITIH4),甲状腺素转运蛋白,(transthyretin),验证：,IgAN R,和,IgAN NR,之间尿差异蛋白显著不同,免疫杂交：低水平的尿,激肽原,提示,IgAN,对,ACEI,治疗反应差的预测指标,Proteomics,8,(1):206-216.,肾小球肾炎,Mischak,（,2004-2005,）,方法：,CE-MS-,生物信息的方法,构建一个尿液（和其他体液）蛋白质组诊断模型用于各种可以进展为肾衰的小球疾病的诊断和鉴别诊断。,MCD(16),、,MN(18),、,FSGS(10),与正常尿液,(57),Kidney Int,2004,65(6):2426-34,Kidney Int,2005,67(6):2313-20,Mass Spectrom Rev.2009;28(5):703,724.,肾小球肾炎,正常组多肽模式：,173,个在,90%,以上正常人尿液中出现的多肽，,690,个在,50%,以上正常人尿液中出现的多肽，,疾病分别构建了含,500,个以上多肽模式,对疾病分类的准确性：,MCD/FSGS 71.4%,，,MN 92.9%,。,Kidney Int,2004,65(6):2426-34,Kidney Int,2005,67(6):2313-20,Mass Spectrom Rev.2009;28(5):703,724.,狼疮性肾炎,Mosley et al.(,2006,),SELDI-TOF MS,差异蛋白：,m,/,z,3340,和,3980 Da,活动和非活动,LN,：敏感性和特异性均,92%,预测,LN,的复发与缓解,未作进一步鉴定,active(,n,=26)and inactive(,n,=49)lupus nephritis patients ROC curve for the two biomarkers was generated using logistic regression scores,with an area under the curve of 0.967.,狼疮性肾炎,Suzuki et al.(,2009,),SLE,或青少年特发性关节炎：,8,种生物标记物,m,/,z,of 2.7,22,23,44,56,79,100,133 kDa,（,LN,）,鉴定：,23-kDa,：脂质运载蛋白型 前列腺素,-D,合成酶,(L-PGDS),56-kDa,：,1,酸性糖蛋白,(AGP)or,类粘蛋白,(orosomucoid,ORM),79-kDa,：转铁蛋白,(Tf),133-kDa,：铜蓝蛋白,(Cp),其它：白蛋白或白蛋白片段,这些蛋白可能可作为预测,LN,病程,Pediatr Res.2009 May;65(5):530-6.,狼疮性肾炎,Zhang et al.(,2008,),方法：,SELDI-TOF-MS,选择,27/176,种差异表达蛋白（不同活动期）,3,中低分子生物标记物,Hepcidin,的,20,、,25,氨基酸异构体,1-antitrypsin,片段,白蛋白,肝性杀菌肽,(hepcidin),：与,LN,促炎症细胞因子有显著相关意义,Kidney International 74,799,807(2008),Urine SELDI spectra of class IV SLE nephritis flarecycles.(a)The spectra of a whole flare cycle are presentedbetween the 2000 and 10,000 Da region.The LMW urineproteome shows an overall increase in peaks between 2000 and4000 Da as flare approaches,which then decrease during flaretreatment.,(b)The spectra from 4 months pre-flare and flare of a class IV GN patient showing that some protein ions decrease at the flare.,Intrarenal expression of hepcidin.Immunohistochemical staining for hepcidin is shown for renal biopsy material from a normal kidney(CONT),and three patients with class IV SLE nephritis(SLE).The positive cells are infiltrating interstitial leukocytes.,甘露聚糖结合凝集素,(mannose binding lectin,MBL),与造影剂引起的急性肾损伤,(CIN),有关,凝集素途径可能参与造影剂致肾损伤,MBL:CIN,可能的生物标记物,造影剂肾损伤,ARF,Exosomal fetuin-A:biomarker of AKI,大鼠,ARF,模型,-,患者,Western blots,证实,ischemic ARF:,血浆谱,:NGAL,、,cystatin C,尿谱,:NGAL,IL-18,KIM-1,cystatin C,a,1-MG,fetuin-A,Gro-alpha,meprin.,评价,ARF,的持续时间和严重性,预测疾病的进展和不良临床预后,有助于区分,ARF,的不同病因学,Kidney Int.,2006;70:18471857.,Curr Opin Nephrol Hypertens.,2008;17:127132,肾脏纤维化机制研究,Phosphoproteomic Study of Human Tubular Epithelial Cell in Response to Transforming Growth Factor,-1-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition,Yong-Xi Chen,Ya Li,Wei-Ming Wang,Wen Zhang,Xiao-Nong Chen,Yin-Yin Xie,Nan Chen,Am J Nephrol 2010;31:2435,利用同位素标签技术（,iTRAQ,）,对,TGF-,诱导人肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白的蛋白质组学研究,结果：,TGF-,可致肾小管上皮细胞损伤,转分化,-,形态学改变,转分化,-,形态学改变,促凋亡,-,流式,促凋亡,-,流式,TGF-,b,1,致肾小管上皮细胞损伤,转分化,-R,eal-time PCR,转分化,-,Western blot,结果：磷酸化蛋白富集,1,2,3,1,2,3,1,2,3,3,3,2,1,1,2,结果,：,iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS,分析,本次质谱鉴定,检测到,2493,个质谱峰,(spectra),鉴定出,1298,个质谱峰，所有检测出质谱峰,521%,（,1298/2493,）,特异性肽段数为,818,个,通过,ProteinPilot,软件鉴定出差异蛋白,38,个,19,表达上调,19,表达下调,结果,：,19,个表达下调磷酸化蛋白及磷酸化位点,结果,：,19,个表达上调磷酸化蛋白及磷酸化位点,结果,：,PANTHER,功能分类结果,上调磷酸化蛋白,19,个，功能分类总共有,22,个,部分蛋白存在多种功能,DNAH5-Dynein heavy chain 5,ERC1-ELKS/RAB6-interacting/CAST family member 1,GAK-Cyclin G-associated kinase,蛋白分类中占到前三位,细胞骨架蛋白,核酸结合蛋白,分子伴侣,结果,：,Western blot,验证磷酸化蛋白差异表达,对,HK-2,予以不同时间,TGF-,b,1,刺激后,磷酸化,moesin,、磷酸化,HSP90,a,表达上调,与,iTRAQ,结果一致,结果,：,TGF-,致肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白调控网络,表达上调磷酸化蛋白中，,13,个蛋白存在相互作用,细胞死亡调控,能量代谢,蛋白调控,应激和防御等细胞事件,参与网络调控蛋白涉及,NF-,k,B,MAPK,等信号蛋白,结语,尿液蛋白组学,生物学标记,-,肾脏疾病以及非肾脏疾病（冠心病、前列腺癌、膀胱癌等）,许多生物标志物被发现,更好理解肾脏的病理生理学,结语,需要标准化的尿液蛋白组学分析,推荐步骤：,确定明确的临床问题,标本收集和准备的方案,可靠的、高通量、高效的技术分析平台,适当的统计方法：与专业相结合,通过大样本对潜在的标记物进行进一步验证,对潜在的生物标记物分析（包括测序等）,结语,不存在“完美的标志物”,明确对应某种疾病的单一分子,一组标志物：更适合疾病的诊断检测和疗效观察,谢谢！,谢 谢！,