TaKaRa定量PCR介绍.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,代理商培训报告,*,*,July 7,2026,实时荧光定量,PCR,介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主 要 内 容,Real Time PCR,基础知识,1,2,Real Time PCR,实验方法,3,Real Time PCR,解析方法,4,Real Time PCR,应用实例,实时荧光定量,PCR,介绍,2,07 July 2026,Real Time PCR,基础知识,1.,Real Time PCR,的用途及原理,2.,Real Time PCR,的检测方法,Real Time PCR,基础知识,1,实时荧光定量,PCR,介绍,3,07 July 2026,Real Time PCR,的用途,Real Time PCR,用途,定性分析,定量分析,病毒及病原菌定量分析,导入基因拷贝数解析,GMO,定量检测,差异显示结果验证,基因芯片结果验证,siRNA,效果确认,mRNA,表达量分析,病毒及病原菌检测,物种鉴定,基因分型,绝对定量,相对定量,实时荧光定量,PCR,介绍,4,07 July 2026,Real Time PCR,的原理,激发光,发射光,使用,Real Time PCR,扩增装置实时监测,PCR,扩增产物并进行分析的方法。,Real Time PCR,Ct,值,实时荧光定量,PCR,介绍,5,07 July 2026,Real Time PCR,的原理,同一个样品重复,96,次,PCR,的扩增曲线,Ct,值,实时荧光定量,PCR,介绍,6,07 July 2026,Real Time PCR,扩增过程中，每个反应管内的,荧光信号值,达到设定的,阈值,时所经历的循环数。,(,C-,代表,Cycle,，,t-,代表,threshold,）,Ct,值概念,阈值,：在扩增曲线的,指数增长区域,内适当位置上设定的,荧光检出界限。Real Time PCR,中的概念,实时荧光定量,PCR,介绍,7,07 July 2026,在,PCR,反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个,PCR,进程，,最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,Real Time PCR,的原理,实时荧光定量,PCR,介绍,8,07 July 2026,生产厂商,仪器名称,TaKaRa,公司,Thermal Cycler Dice TP800,Applied Biosystems,公司,ABI PRISM 7700,、,7000,、,7300,、,7900HT,、,7500Fast,Roche,公司,LightCycler,2.0,、,LightCycler,480,Cepheid,公司,Smart Cycler,、,Smart Cycler II,、,Smart Cycler,TD,Bio-Rad,公司,iCycler iQ,、,iQ5 Real-Time PCR Detection System,Corbett Research,公司,Rotor-gene2000,、,Rotor-gene3000,、,Rotor-gene6000,MJ Research,公司,Opticon,、,MJ Mini Cycler,、,MiniOpticon,Stratagene,公司,Mx4000,、,Mx3000P,、,Mx3005P,TM,杭州博日,LINE-GENE FQD-33A,、,LINE-GENE FQD-66A,Real Time PCR,检测系统,-,简介,实时荧光定量,PCR,介绍,07 July 2026,LightCycler,480,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005P,TM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,TaKaRa TP800,实时荧光定量,PCR,介绍,07 July 2026,各公司,Real Time PCR,检测系统比较,仪器名称,反应孔数,反应孔间,独立性,检出通道,升降温速度,Tube,ROX,荧光,校正功能,TaKaRa Dice TP800,96,无,2-4,快,0.2ml,普通,Tube,无,ABI7000,96,无,4,快、慢两种,0.2ml 8,联管、,专用,Cap,有,ABI7500 Fast,5,快,Light Cycler2.0,32,无,6,快,专用毛细玻璃管,无,Light Cycler 480,96 or 384,5,快,专用板,Smart Cycler,16(6,16),有,4,快,专用、塑料石英,无,Rotor-Gene 3000,36(0.2ml),72(0.1ml),无,4,慢,0.2ml,为普通,Tube,0.1ml,为专用,Tube,无,MiniOpticon,48,无,2,快,0.2ml,普通,Tube,无,iQ5 Real-Time PCR,Detection System,96,无,5,快,0.2ml,普通,Tube,无,LINE-GENE,FQD-66A,66,无,4,快,0.2ml,普通,Tube,无,Mx3000P,96,无,4,慢,0.2ml 8,联管,或单管,有,Mx3005P,TM,5,实时荧光定量,PCR,介绍,07 July 2026,Real Time PCR,基础知识,1.,Real Time PCR,的用途及原理,2.,Real Time PCR,的检测方法,Real Time PCR,基础知识,1,实时荧光定量,PCR,介绍,12,07 July 2026,TaqManProbe,Cycling,Probe,Molecular,Beacon,etc.,SYBR,Green I,荧光染料嵌合法,荧光探针法,Real Time PCR,的检测方法,实时荧光定量,PCR,介绍,13,07 July 2026,荧光染料嵌合法（,SYBR Green I,）,SYBR Green I,：是一种能结合于所有,dsDNA,双螺旋小沟区域的,具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,实时荧光定量,PCR,介绍,14,07 July 2026,Primer,退 火,F,F,F,F,SYBR Green I,法,作用机理示意图,Pol.,F,Primer,Pol.,延 伸,F,F,F,F,F,F,Primer,热变性,F,F,F,F,实时荧光定量,PCR,介绍,15,07 July 2026,TaqMan,法作用机理,TaqMan,探针为一寡核苷酸，,5,端标记一个报告基团（,Reporter,），,3,端标记一个淬灭基团（,Quencher,）。,R,Q,实时荧光定量,PCR,介绍,16,07 July 2026,R,Q,Primer,R,Q,Primer,R,Q,Primer,Pol.,Pol.,热变性,退 火,延 伸,TaqMan Probe,法原理示意图,实时荧光定量,PCR,介绍,17,07 July 2026,CycleavePCR,法原理,Cycling probe,为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基,团（,Reporter,），一端标记一个荧光淬灭基团（,Quencher,），,寡核苷酸为,DNA/RNA,杂合体。,RNase H,Q,RNA,R,实时荧光定量,PCR,介绍,18,07 July 2026,热变性,Primer,Q,F,Primer,Pol.,退 火,Q,F,RNase H,Primer,Pol.,延 伸,Q,F,CycleavePCR,法原理示意图,实时荧光定量,PCR,介绍,19,07 July 2026,One-Step RT-PCR,特异性高,多重,PCR,检出,Probe,设计要求高,Probe,法,Probe,合成费用高,SYBR Green I,法与,Probe,法比较,常用于,mRNA,表达量分析等,SYBR Green I,法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重,PCR,常用于,SNP,解析，病毒、病源菌检测,实时荧光定量,PCR,介绍,20,07 July 2026,主 要 内 容,2,Real Time PCR,实验方法,反转录反应,O,ne Step,和,Two Step RT-PCR,的选择,RT Primer,的选择,Total RNA,中,Genomic DNA,混入的对策,Real Time PCR,引物及探针的设计,引物反应性确认,PCR,条件优化顺序,Real Time PCR,反应,实时荧光定量,PCR,介绍,21,07 July 2026,O,ne Step,和,Two Step RT-PCR,的选择,Two-Step RT-PCR,RNA,RT,反应,PCR,反应,cDNA,One-Step RT-PCR,实时荧光定量,PCR,介绍,22,07 July 2026,Two-Step RT-PCR,高扩增效率,cDNA,使用更加灵活,更多,RT Primer,选择,常用于,mRNA,表达量分析等,One-Step RT-PCR,操作简便,有效降低污染,特异性,RT Primer,One-Step RT-PCR,常用于病毒、病源菌检测等,O,ne Step,和,Two Step RT-PCR,的选择,实时荧光定量,PCR,介绍,23,07 July 2026,RT,Primer,的选择,Random Primer,Oligo dT Primer,Gene Specific Primer,Random 6mer Primer,Gene Specific Primer,Oligo dT Primer,PCR R-Primer,PCR F-Primer,实时荧光定量,PCR,介绍,24,07 July 2026,目的片段在距,Poly(A)Tail 1.5 kbp,以内适用，,RT,效率较高。,One Step RT-PCR,只能使用,Gene Specific Primer,，但不适用于复数基因的检出。,5,3,Gene Specific Primer,目的片段,R,F,AAA,5,3,目的片段,R,F,1,500 base,Oligo dT Primer,Random,目的片段,5,3,R,F,目的片段在,mRNA,任何位置都能使用。通常,mRNA,表达量分析最适。,Oligo dT Primer,5,3,R,F,AAA,目的片段,Random,适用于,mRNA,表达量分析，提升反应检测的灵敏度。,RT,Primer,的选择,实时荧光定量,PCR,介绍,25,07 July 2026,Total RNA,中,Genomic DNA,混入的对策,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Small PCR Product,Small PCR Product,此种情况必须采用,DNase I,处理，去除基因组,DNA,。,融解曲线分析,实时荧光定量,PCR,介绍,26,07 July 2026,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Long PCR Product or No Product,Small PCR Product,融解曲线分析,可以区分,cDNA,或者基因组,DNA,来源的扩增产物。,Total RNA,中,Genomic DNA,混入的对策,实时荧光定量,PCR,介绍,27,07 July 2026,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,No Product,Small PCR Product,融解曲线分析,Total RNA,中,Genomic DNA,混入的对策,实时荧光定量,PCR,介绍,28,07 July 2026,Real Time PCR,引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR,用引物与普通,PCR,引物设计要求不同,=,对引物设计要求严格,普通,PCR,引物,Real Time PCR,引物,实时荧光定量,PCR,介绍,29,07 July 2026,两条引物的,Tm,值尽量接近，应用专用软件计算,Tm,值,Tm,值,40-60%(,最好,45-55%),GC,含量,Primer,长度,80-150 bp(,尽量限制在,300 bp,以内,),扩增片段大小,17-25 base,使用,BLAST,检索，确认引物特异性,特异性,引物内部或两条引物之间避免,3 base,以上的互补序列,引物,3,末端避免,2 base,以上的互补序列,互补性,3,末端序列,整体上碱基不能过偏,个别部分避免,GC rich,或,AT rich(,特别是,3,端,),避免,T/C,连续，,A/G,连续,序列,3,末端避免,GC rich,或,AT rich,3,末端碱基最好为,G,或,C,3,末端碱基尽量避免为,T,尽量在,Exon junction,上设计引物，限制基因组,DNA,扩增,RT-PCR,用引物,Real Time PCR,引物设计原则,实时荧光定量,PCR,介绍,30,07 July 2026,RefSeq,序列,目的基因序列获得,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time RT-PCR,引物,好的引物,需要寻找好的参照序列,Real Time PCR,引物设计,通过,NCBI,获得参考序列和相关情报。,RefSeq,数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。,序列可信度高，信息量大,实时荧光定量,PCR,介绍,31,07 July 2026,LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005,DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase(Pah),mRNA.,ACCESSION NM_008777,VERSION NM_008777.1 GI:6679202,SOURCE Mus musculus(house mouse),ORGANISM Mus musculus,FEATURES Location/Qualifiers,gene 1.1959,/genePah,/db_xref=GeneID:18478,/db_xref=MGI:97473,CDS 48.1409,/gene=Pah,/note=go_function:iron ion binding goid 0005506,/protein_id=NP_032803.1,/db_xref=GI:6679203,/db_xref=GeneID:18478,/db_xref=MGI:97473,ORIGIN,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg,61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca,121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag,181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca,241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata,301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca,361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca,421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag,481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg,541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga,601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg,661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc,721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg,781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact,841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc,901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg,961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt,1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg,1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc,1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc,1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca,1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg,1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt,1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg,1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag,1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc,1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag,1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,GenBank file,NM_008777,Mus musculus phenylalanine hydroxylase(Pah),mRNA.,Real Time PCR,引物设计,目的基因序列获得,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time RT-PCR,引物,实时荧光定量,PCR,介绍,32,07 July 2026,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg,61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca,121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag,181 ttggtgc,cct,ggccaaggtc,ctgcg,cttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca,241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata,301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca,361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa aga,acacagt,gccctggttc,cca,aggacca,421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag,481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg,aaagcagttt,gctgacattg,541,cctac,aacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga,601 agacctgg,gg,aacggtgttc,aggactctga,a,ggccttgta taaaacacat gcctgctacg,661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc,721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg,781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact,841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc,901 atga,actctt,gggacatgtg,cccttg,tttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg,961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt,1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg,1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc,1141 t,gcccctgga,gctagagaag,a,cagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc,1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca,1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg,1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt,1381 gccatgccct gcagaaaat,a,aagtcatgaa,cagaaagtga,cgtcatagac agaacttagg,1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag,1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttc,c,taacatagtg,gaggatcac,c,1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag,1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTG,G,GACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGG,G,C,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,Real Time PCR,引物设计,目的基因序列获得,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time RT-PCR,引物,实时荧光定量,PCR,介绍,33,07 July 2026,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTG,T,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCT,TGG,GACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCT,CCA,GGG,G,C,AAAGTCA,T,GAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5,-,5,-,5,-,5,-,5,-,5,-,5,-,5,-,-3,-3,-3,-3,SNP,3,末端的,T,3bp,互补,Real Time PCR,引物设计,目的基因序列获得,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time RT-PCR,引物,实时荧光定量,PCR,介绍,34,07 July 2026,Real Time PCR,引物设计,目的基因序列获得,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time RT-PCR,引物,31,实时荧光定量,PCR,介绍,35,07 July 2026,探针的,Tm,比引物高,8-10,Tm,值,20-24 bp,Probe,长度,探针,5,末端的第一个碱基不能是,G,5,末端序列,目的序列,GC,含量相对较高的区域设计,整体上碱基不能过偏,个别部分避免,GC rich,或,AT rich(,特别是,3,端,),；避免,T/C,连续，,A/C,连续,序列,Probe,内部或,Probe,与两条引物之间避免,3 base,以上的互补序列,互补性,BLAST,检索确认,Probe,特异性,特异性,Real Time PCR,用,TaqMan,探针设计原则,Real Time PCR,探针设计原则,实时荧光定量,PCR,介绍,36,07 July 2026,探针荧光标记物的选择,淬灭基团种类,淬灭基团性质,使用的报告基团的种类,TAMRA,荧光物质,FAM,，,HEX,，,TET,，,JOE,等,Eclipse,非荧光物质,FAM,，,HEX,，,TET,，,JOE,，,TAMRA,，,ROX,等,BHQ,系列染料,BHQ1,非荧光物质,FAM,，,HEX,，,TET,，,JOE,等,BHQ2,非荧光物质,CY3,，,TAMRA,，,ROX,，,TexasRed,，,CY5,等,BHQ3,非荧光物质,CY5,等,常用报告基团与淬灭基团的相匹配的探针组合,实时荧光定量,PCR,介绍,37,07 July 2026,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR,扩增效率（,E,）：,0.8-1.2,35Cycles,内可得到好的定量结果。,如果采用,SYBR,检测方法，,30Cycles,内无非特异性产物扩增。,No,T,emplate,C,ontrol,确认,30Cycles,内无引物二聚体产生。,相关系数（,r,2,）：大于,0.98,反应性能确认,实时荧光定量,PCR,介绍,38,07 July 2026,标准,Protocol,95 5 sec.,60 30 sec.,B.,有非特异性扩增时,提高退火、延伸温度,缩短退火、延伸时间,降低引物浓度,PCR,条件优化顺序,A.,扩增效率低时,延长退火、延伸时间,降低退火、延伸温度,改为三步,PCR,，降低退火温度,提高引物浓度,实时荧光定量,PCR,介绍,39,07 July 2026,主 要 内 容,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,实时荧光定量,PCR,介绍,40,07 July 2026,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：,5,6,个梯度,标准品稀释倍数的选择：,标准品稀释倍数通常为,5-10,10,5,10,4,10,3,10,2,10,1,10,0,10,5,10,4,10,3,10,2,10,1,10,0,实时荧光定量,PCR,介绍,41,07 July 2026,标准品的种类,基因组,DNA,质粒,Total RNA&cDNA,体外转录,RNA,DNA,样品定量标准品,RNA,样品定量标准品,实时荧光定量,PCR,介绍,42,07 July 2026,质粒标准品的构建,紫色,部分为,Real Time,引物区,红色,部分为标准品构建用引物区,质粒标准品引物设计,AGTACCTAGATCCTAG,AGTACCTAGATCCTAG,TCCTCCTGAGCGCAAGTACTC,ATTGCCGACAGGATGCAGA,实时荧光定量,PCR,介绍,43,07 July 2026,质粒标准品构建流程,基因组,DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，,OD,值定量。将质粒梯度稀释至,10,5,-10,1,copies/ul,，作为标准品。,实时荧光定量,PCR,介绍,44,07 July 2026,RNA,标准品构建,紫色,部分为,Real Time,引物区,红色,部分为标准品构建用引物区,蓝色,部分,T7,启动子和,Poly(T),ATTGCCGACAGGATGCAGA,TCCTCCTGAGCGCAAGTACTC,实时荧光定量,PCR,介绍,45,07 July 2026,体外转录,RNA,标准品构建流程,RNA,纯化后，测,OD,定量。将,RNA,梯度稀释至,10,5,-10,1,copies/ul,，作为标准品。,T7 RNA polymerase,体外转录,RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTT,T,PCR,产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAA,A,AAAA,A,实时荧光定量,PCR,介绍,46,07 July 2026,理想的标准品扩增曲线,基线平整,Negative Control,为水平线,指数区较明显，陡度大,平台区汇于一起,线性范围宽,实时荧光定量,PCR,介绍,47,07 July 2026,理想的标准曲线,相关系数（,r,2,）：大于,0.98,，越接近,1,，结果可信度越高。,扩增效率（,E,）：,0.8-1.2,，越接近,1,，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（,E,）计算方法,标准曲线,X,轴表示起始模板浓度（,log,10,),，,Y,轴表示,Ct,值时,E=10,-1/a,-1,标准曲线,X,轴表示,Ct,值，,Y,轴表示起始模板浓度（,log,10,),E=10,-a,-1,实时荧光定量,PCR,介绍,48,07 July 2026,Real Time PCR,解析方法,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,实时荧光定量,PCR,介绍,49,07 July 2026,融解曲线分析,Tm,值是指双链,DNA,分子解链一半时的温度。,SYBR Green I,法进行检出时，,要根据融解曲线确认,PCR,产物的特异性。,实时荧光定量,PCR,介绍,50,07 July 2026,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对,PCR,产物特异性进行分析,融解曲线分析,实时荧光定量,PCR,介绍,51,07 July 2026,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,Real Time PCR,解析方法,实时荧光定量,PCR,介绍,52,07 July 2026,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,Real Time PCR,反应,数据分析,流,程,实时荧光定量,PCR,介绍,53,07 July 2026,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,10,5,10,4,10,3,10,1,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,10,2,实时荧光定量,PCR,介绍,54,07 July 2026,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，,进行相对表达量分析。,Sample B,Sample A,目的基因扩增效率相同,RNA,提取效率相同,细胞起始数相同,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,实时荧光定量,PCR,介绍,55,07 July 2026,相对定量解析方法,管家基因,维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如,：,GAPDH、-actin,等。,筛选方法,根据文献提供,通过具体实验筛选,实时荧光定量,PCR,介绍,56,07 July 2026,相对定量解析方法,通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后以管家,基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对值即为相对表达量。,相对值,=,校正值,=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品的校正值,对照样品的校正值,通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的,Ct,值，然后以管家基因的,Ct,值为,依据对目的基因进行差值校正，最终求得相对表达量。,双标准曲线法,Ct,法,相对值,=2,-,Ct,(,目检,-,管检,),-,Ct,(,目对,-,管对,),实时荧光定量,PCR,介绍,57,07 July 2026,主 要 内 容,Real Time PCR,基础知识,1,2,Real Time PCR,实验方法,3,Real Time PCR,解析方法,4,Real Time PCR,应用