实时定量PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实时定量,PCR,（qRT-PCR）,实时定量,PCR,（qRT-PCR）,Polymerase Chain Reaction,（PCR）聚合酶链式反应,伟大的天才发现！,Kary B.Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复1,3步,25,30轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,子链延伸,DNA加倍,DNA变性,形成2条单链,PCR的基本原理,PCR的基本原理,模板DNA,9,4,50,-65,引物1,引物2,DNA引物,72,PCR的基本原理,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,第1轮结束,9,4,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50-65,Taq,Taq,Taq,Taq,72,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,第2轮结束,PCR基本原理,Mg,2+,模板,引物,dNTPDNA,聚合酶,PCR,PCR反应,基本要素,1、,单、双链DNA,，cDNA,均可,2、,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类,3、,一般100ng,DNA模板/100,L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加,（1）模板,1、引物浓度一般为,0.1-0.5 mol/L,，,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降,2、引物的设计,（2）引物,（3）,Taq,DNA聚合酶,1、酶的用量一般为,0.5-2.5 U/50,l,，,2、,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（,4,）Mg,2+,1、,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂,，一般用量为,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。,2、,Mg,2+,浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg,2+,过高影响反应特异性。,3、,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg,2+,浓度。,1、,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,2、,四种dNTP浓度应相等,3、,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,4、,dNTP可与Mg,2+,结合，使游离的Mg,2+,浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（,5,）dNTP,变性,使双链DNA解链为单链,94,3,0-,4,0,s,退火,温度由,引物长度,和,GC含量,决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,循环参数,（3）延伸,68,-7,5,一般为72,延伸时间由扩增片段长度决定,（4）循环次数,主要取决于,模板,DNA的浓度,一般为,25-35,次,次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加,常用PCR反应体系(以HiFi Taq为例),模板,1.0 L,上游引物,0.5 L,下游引物,0.5 L,10X HiFi Buffer,（+Mg,2+,）,2.5 L,dNTPs,2.0 L,HiFi Taq酶,0.2-0.3 L,ddH,2,O,补足25 L,共,25 L,常用PCR反应条件,94 2-5min,94 30-40s,Tm,30-45s,72,1min/1kb,72 10min,12 +,25-35个循环,几种常用PCR技术,RT-PCR,(Reverse Transcription PCR),反向PCR,(,R,everse PCR),RACE,(,R,apid-,A,mplification of cDNA,E,nds),qRT-PCR(Q,uantitative,R,eal,T,ime,PCR,),基因,mRNA,蛋白质多肽链,RT-PCR(反转录PCR),DNA水平,RNA水平,蛋白水平,RT-PCR基本原理,mRNA,AAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTT,Reverse Transcription,mRNA,AAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTT,cDNA,RT-PCR一般步骤,1、RNA提取,RNA质量的检测,一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的,完整性,和,纯度,完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）,纯度检测（OD260/280）,OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解,28S,18S,5S,2、反转录,RT-PCR一般步骤,在冰盒上加入以下试剂：,组成,体积,随机引物,或Oligo dT,）,1,L,1-5,g,Total RNA,x,L,DEPC-Treated H,2,O,y,L,体系配制完成后瞬时离心，70,反应5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,此步骤的作用是,去除mRNA的二级结构,。,RT-PCR一般步骤,组成,体积,5X Buffer,4,L,dNTPs,1,L,RNAse inhibitor,1,L,M-MLV,1,L,DEPC-Treated H,2,O,x,L,1、混匀，42，,9,0min,2、,70,，,10,min，终止反应,3、A3检测,在冰盒上加入以下试剂：,反向,PCR(reverse,）,PCR),已知序列,未知序列,未知序列,反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增,。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,反向PCR,原理,cDNA 末端快速扩增技术(,R,apid,A,mplification,of cDNA,E,nds,RACE)是一种基于PCR,技术,从低丰度的转录本中快速扩增cDNA 的5和3末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。,RACE,(rapid-amplification of cDNA ends),AAAAAAAA,mRNA,接头序列,AAAAAAAA,mRNA,GeneRacer,3Primer,GSP2,GeneRacer,3Nested Primer,NGSP2,Reverse transcription,GeneRacer,Oligo,dT,Primer,TTTTTTTTT,GTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG,cDNA,TTTTTTTTT,GTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG,已知片段,RACE,3RACE原理,mRNA,AAAAAA,mRNA,NNNNNNNNNNN,AAAAAA,Oligo dT,Reverse Transcription,NGSP1,GeneRacer5Nested Primer,GSP1,GeneRacer,5,Primer,GeneRacer RNA Oligo Sequence,NNNNNNNNNNN,接头序列,TTTTTT,NNNNNNNNNNN,cDNA,mRNA,AAAAAA,NNNNNNNNNNN,已知片段,5RACE原理,qRT-PCR(Q,uantitative,R,eal,T,ime PCR,),通过,荧光染料,或荧光标记的特异性,探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料,SYBR Green,I,序列特异性探针,Taqman,Molecular Beacons,Dual Probes(,FRET),引物特异性探针,Amplifluor,(,Intergen,),1,、,SYBR Green,法,SYBR Green,工作原理,SYBR Green,法优缺点,融解曲线（dissociation curve）,正常,有非特异性扩增,2,、,TaqMan,探针法,作用机理,TaqMan,TaqMan,法,与SYBR Green I的比较,几个重要概念,基线（,Baseline,）,荧光阈值（,threshold,）,荧光阈值（,threshold,）,是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的,10,倍。荧光域值是,PCR3,15,个循环荧光信号标准差的,10,倍，荧光域值设定在,PCR,扩增的指数期。,C,t,值（,threshold value,）,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为,C,t,值。,研究表明，各模板的,C,t,值与该模板的,起始拷贝数,的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,C,t,值越小。反之亦然。,定量,PCR,的数学原理,荧光定量PCR的解析方法,相对定量,内参基因,目的基因,1,2,0.2,内参基因,内参基因,：qRT-,PCR,时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是管家基因，一般用,-,actin,，有时也用,GAPDH,。,管家基因,：又称,持家基因,(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。,内参基因的选择,理想的内参基因应该满足以下条件,：,1、不存在假基因，以避免基因 DNA的扩增,2、高度或中度表达，排除低表达,3、稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别,4、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关,5、其稳定的表达水平与目标基因相似,6、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响,常用内参基因,家蚕,常用内参基因,Actin,3,GAPDH,sw22934,数据,处理（Ct法）,q,RT,-,P C R的优点及限制因素,qRT-PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有,操作简便,、,快速高效,、,敏感性,高,、,特异性,强,、有效解决了,PCR污染,的问题、,自动化程度高,等特点,优点,qRT-PCR限制因数,实验费用昂贵，需要设置多组重复和对照,怎样避免扩增基因组DNA,、,如何消除和评定由于样品处理、仪器的差异和个人操作而带来的误差以及如何更准确定量基因,？,值得指出的是,，,qRT-PCR,只能定量,mRNA,水平,，,但,mRNA,水平可能不能反映细胞中蛋白水平,，,因为在转录后还有,诸多,调节因素。,要准确而全面的了解机体的表达水平,，,除了分析,mRNA,水平外,，,还需要免疫组织化学和生物化学实验的数据。,更多关于qRT-PCR的信息，请参照,：,引物设计,常用引物设计软件：primer Premier，Oligo,序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列,引物长度：,17-25bp,碱基尽可能随机分布,GC%：,40%-60%,尽量避免,错配（False Priming)、引物二聚体(Dimer),和,发夹结构（Hairpin）,常规PCR引物设计,引物设计,qRT-PCR引物设计,引物长度：,17-25bp,GC%:,40-60%,Tm:,60,（Primer Premier 5.0）,产物长度：,80-300bp,100-200bp,最佳,