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按一下以編輯母片標題樣式,Cliquez pour modifier les styles de texte du masque,Second niveau,Troisi,鋗,e niveau,Quatri,鋗,e niveau,Cinqui,鋗,e niveau,*,H:,marco,industry,api,train,API,系统,-构成:,试条由特別选择的生化反应小管,API,试条有多种类,各有相应的数据库,所有生化结果以同时间一并阅读,API,系统,试条由10,20,50.测试组成不等,结果：鉴定百分率,基本单位：条目（,Taxa,)-,种(,Pseudomonas Aeruginosa,)-,生物型号(,E.,Coli,1)-,属(,Salmonella,Spp,.)-,一群菌种(,Aeromonas hydrophilia,/,cavicie,),所引用的分类学跟国际认可的一样-,International Journal of Systematic Bacteriology,资料库整个系统的心脏,API,资料库，不断更新，跟据,-分类学的进化,-新的菌种,-生化反应的演进,-鉴定菌种需要的改变,优点：,-标准化，简易化,-在制造过程中，进行质控,-,FDA,标准,-用家可用,ATCC,菌种进行质控,-系统化,-操作简易,-快速报告,-20年经验，拥有菌种资料25000，鉴定系统的发源生化测试750,-1500文献,與不同国家地區的权威机构交流,美国,日本,澳大利亞,欧洲,API,鉴定范围,庞大资料库,15种试条,550种细菌可被鉴定,研究用试条：乳酸杆菌，芽胞菌，变曲菌,简单方便,以同一基础概念运用,标准化方法,快速结果,4-24小时,降低成本,成品化，单一化试剂,简单判读结果,选条的标准,革兰氏阴性杆菌分类,革兰氏阴性杆菌,氧化酶,+,非,肠道,菌鉴定,API 20NE,肠道杆菌鉴定,API 20E,氧化酶-,革兰氏阳性杆菌分类,革兰氏阳性杆菌,触酶,-,触酶,+,短小脱色含有异染颗粒,slight discoloration,(,granulations,),短球杆菌,延长状杆菌,细小不透光菌落,20-25,C,有动力,37,C,无动力,李斯特菌鉴定,API,Listeria,乳酸菌鉴定,API 50CHL,棒状杆菌鉴定,API,Coryne,大体积产芽孢杆菌,芽孢菌鉴定,API 50CHB,革兰氏阳性球菌分类,革兰氏阳性球菌,凝固,酶,葡萄球菌鉴定,API,STAPH,触酶,-,触酶,+,金黄色萄葡球菌,溶血,链球菌鉴定,API STREP,+,-,定向试验,-在细菌学里最普遍的染色方法,革兰氏染色,步骤,G(,),G(,),-染色前，所有细胞是透明的,-结晶紫着色後用碘增加染料与菌体结合,-乙醇从,G(,),菌体洗脱结晶紫,-用番红液复染，革兰氏阴性菌呈粉红色，革兰氏阳性菌呈兰紫色,Color Gram 2,革兰氏染色剂,即可用试剂,-,R,1,=,草酸盐-结晶紫溶液,-,R,2,=,稳定化卢哥氏-,PVP,液,-,R,3,=,脱色剂,-,R,4,=,番红液,技术要点,-使用新鲜培养细菌(24-48小时),-,脱色过度会使,G+,菌染成,G-,Color Gram 2,染色剂,试剂组成,R,1,=240 ml x 1,R,2,=240 ml x 1,R,3,=240 ml x 1,R,4,=240 ml x 1,所有试剂,瓶,带,滴,咀,于,18-25,C,储存,革兰氏染色液 2(,Color Gram 2),-特性稳定化的碘液,PVP(,聚氯乙烯吡咯烷酮)可以防止因碘挥发而变质,，,同时也增强了媒染效果。,更容易分别,G(),及,G(-),菌,高质量的结晶紫和番红,，,无沉淀。,接解酶,试,剂,-原 理,-传统方法,H,2,O,2,2,H,2,O+O,2,接 解 酶,玻片法,试管法,接触酶试剂,容许,于,平板(包括血平板)上作直接检测,组成:,-增稠剂:高粘度集中所产生的气泡,防止试剂扩散,-,Evans,兰,:兰色使结果更容易阅读,-3%H,2,O,2,-玻片法,-直接在平板上测试,接触酶,检测试,剂,接触酶试验是细菌鉴定中的一个重要反应。由于传统方法的易产生假阳性结果，这个试验没有得到充分应用。,ID Color,Catalase,产品规格,氧化酶试验,-原 理:,TMPD,氧化,TMPD,氧 化 酶,(,TMPD=2,甲基一对一苯撑二胺),货号:55922,纸片:浸泡饱和,TMPD,储存:2-8,C,于暗处,有效期:1年,组成:2,x30,片小瓶装,纸片,货号:70460,储存:2-30,C,于暗处,组成:1个小瓶,液体试剂,(深紫色),(透明),氧化酶纸片法,液体 氧化酶试剂,试剂方法:,-用2个试管载1-2,ml,无菌水,-第一管为阴性对照:加一滴,OX,试剂,-第二管为测试管:加可疑菌落然,后,再加二滴,OX,试剂,-比较二支管的颜色:,阴性对照:,透明,浅紫色,结果:,OX():,透明,浅紫色,OX(+):,紫色,深紫色,生化鉴定,容易使用,API,结果,原理：,-生化结果组合跟资料库內的典型条目(,Taxa,),作出比较,-经计算後，,鉴定百比率（%,Id）,机会率，指示出不同菌类的比较,T,值（,T index）=,指示出在同一個菌类的相似程度,生化鉴定,可靠及具创意的选择,最典型,生化普,菌种,X,T,值,资料库,生化结果,(菌种,X),(菌種,X),API,结果,跟据,T,值及%,Id,的组合，作出评语：,(,i)Excellent Identification,%,Id,99.9,及,T,0.75,(ii)Very good Identification,%,Id,99.9,及,T,0.75,(iii)Good Identification,%,Id,90.9,及,T,0.25,(iv)Acceptable Identification%Id,80.0,及,T,0,(v)Doubtful profile,其中一个,生化反应,出现,严重,违反典型生化结果,API 20E/Rapid 20E,-,肠道杆菌科,细菌在,环境中及动物产品中非常普遍,，,其中部份(沙门氏、耶尔森氏)是致病,菌,-,API 20E,是,常规鉴定中的标准,-其他新鉴定系统比较的金标准,-方便使用，4或24小时出报告,API 20E,试剂条接种要点,先做氧化酶试验，氧化酶为阴性时接种,API 20E,氧化酶为阳性时接种,API 20NE,试剂条,塑料培养盒中加水5,ml,放入试剂条，记录标本资料。,取1个1,mm,大小，1824,hr,菌龄的菌落，分散于5,ml,悬浮液（20150）中，使达0.5,Mac Farland,浊度。,小心沿内壁加菌悬液到微量生化杯中。其中：有,U,形框标记的项目(,CIT、VP、GEL)，,将菌液加满；有下划线标记的(,ADH、LDH、ODC、H,2,S、URE、)，,加好菌悬液后，用无菌液体石蜡封口。,剩余的菌液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。,盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。,孵育盒放入37摄氏度温箱培养24小时。,API 20E,反应结果阅读要领（）,一、若,GLU（,葡萄糖）为阳性，则记录,GLU,的结果，在,TDA、IND、VP,孔中加入相应的附加试剂，1分钟内读取,TDA、IND,的结果，510分钟内读取,VP,的结果。同时读并记录取其它反应的结果，用生化鉴定结果组成一个7位数编码。,二、若,GLU(,葡萄糖)为阴性，但有多于2个的反应呈阳性，则按上述方法读取并记录结果。,三、若,GLU（,葡萄糖）为阴性（非发酵菌），且其它呈阳性的反应不多于2个，则不要加试剂，放回温箱中再培养 24,hr,后,按第一条的方法读取结果。同时用次代培养物接种2个,API OF,培养基证实葡萄糖代谢类型；接种1个,API M,培养基观察动力；划线接种,MacConkey,平板。培养24,hr,后将其结果记录到,API 20E,报告单，与生化鉴定结果一起得到一个9位数编码。,API 20E,反应结果阅读要领（）,ONPG：,淡黄色黄色为阳性，无色为阴性。,ADH、LDC、ODC、URE,以苯酚红为指示剂，橙色红色为阳性，黄色为阴性。,CIT：,管口处出现兰色为阳性，黄色绿色为阴性。,H,2,S：,黑色为阳性，无色浅灰色为阴性。,TDA、IND、VP,加试剂后出现红色为阳性,不出现红色为阴性。,GEL：,黑色素扩散为阳性，不扩散为阴性。,GLUARA,为糖类的酸化反应，指示剂溴百里香酚兰显黄色为阳性，蓝、绿色为阴性。,GLU,为阴性时，记录其结果，并在,GLU,孔中按先后顺序分别加一滴,NIT 1,和,NIT 2,试剂，出现红色时,NO,2,为阳性，,N,2,为阴性；不出现红色时，加少许,Zn,粉，此时出现红色，则,NO,2,为阴性，,N,2,为阳性。,有动力，,MOB,为阳性，无动力则为阴性。,麦康凯平板上生长，,McC,为阳性，不生长为阴性,OF,培养管下部变色为发酵型，,OF-F,为阳性，下部不变色,OF-F,为阴性；,OF,培养管上部变色为发酵型，,OF-O,为阳性，上部不变色,OF-O,为阴性,API 20E,反应结果阅读要领（）,Rapid 20E,技术要点,(,i),试条阅读,a)LDC-ODC:,兰色为阳性结果,-切记加石,蜡,油(因接种孔太小),-因,pH,指示剂跟,API 20E,不同,，切勿混乱,b)IND -3,分钟内阅读,(,ii),不适用,于,非发酵菌,(,iii),用新鲜培养:24小时,(,iv),最好在营养琼脂上挑菌落,(,v),用,0.85%,NaCl,盐水加速细菌生长,(,vi)CIT,孔较易出现假阴/阳性结果,(,vii),最多只能培养5小时否则,PPA,URE,及,ODC,出现假阳性,(,viii),不要经常开关培养箱,(,ix),不需潮湿环境,API 20NE,-,非发酵,G(-),杆菌存在,于,空气、水及表面部份,细菌（,如绿脓假单胞菌,）为,致病,菌,-试条主要由传统生化反应及同化反应小管 所组成,-64条目(,Taxa,),-,非发酵,G(-),杆菌的标准鉴定,方,法,API 20NE,试剂条接种要点（1）,先做氧化酶试验，阳性者接种,API 20NE。,塑料培养盒中加水5,ml,放入试剂条，记录标本资料。,取1824,hr,菌龄的菌落，分散于,ml,盐水（,20040,）中，使达0.5,MacFarland,浊度（,A,液）。,取,A,液200,ul(,滴），加入,AUX,培养液中，小心混匀避免产生气泡，制成同化试验接种液（,B,液）。,用,A,液按,API 20E,相同的方法接种生化试验杯孔（,NO,3,PNPG,其中，,GLU，ADH,URE,用液体石蜡封口）,用,B,液接种同化试验杯孔(下面有三条红线者）。使液面与杯口平齐,B,液黏度很大，特别注意不要使菌悬液堵住杯口，形成大的气泡，影响反应结果。,严格无菌操作，避免空气中的杂菌污染同化试验,剩余的,A,液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。,盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。,孵育盒放入30摄氏度温箱培养24小时。,API 20NE,试剂条接种要点（2）,API 20NE,技术要点,同化试验,项目接种要求,-接种液面,与杯口,平,齐，,太多或不足会,造,成错,误,结果,。,API 20NE,反应结果阅读要领（）,一生化试验：,不要打开塑料培养盒盖，先读取从,GLU,到,PNPG,的生化试验结果并记录之,在,NO,3,杯孔中按先后次序分别加入一滴,NIT1,和,NIT2,试剂，出现红色,NO,3,为阳性不出现红色时，加少许,Zn,粉，此时出现红色，则,NO,3,为阴性，分钟内不出现红色，则,NO,3,阳性,TPR,杯孔中加一滴,James,试剂，立即出现红色为阳性不出现红色为阴性,二同化试验：,从杯口上方往下看，红线模糊或菌悬液变浑浊，表明有菌生长，为阳性否则，为阴性,偶有弱生长者可记录为或,三在报告单上做出一个位数编码，查编码手册或,API LAB,软件,四如果，查不到编码，或给出提示,“,IDENTIFICATION NOT VALID BEFORE 48-HR INCUBATION”,立即用液体石蜡将,NO,3,和,TRP,封口继续培养小时,再读结果而,NO,3,和TRP,要记录培养24小时的结果,API 20NE,反应结果阅读要领（）,API STAPH,-,凝固酶,阴性葡萄球菌,于,环境污染中常见,-其中以金黃葡萄球菌为,代,表,-以,Kloos,and,Schleifer,Classification,为,基础,-试条由传统方法及发酵反应小管组成,-22个条目(葡萄球菌及微球菌),API STAPH,技术要点,(,i),附加试验,第,21-溶葡萄球菌素(,lysostaphin,，,LSTR,),用纸片法做,目的:确认微球菌,经常抗药(+),其他葡萄球菌 ,LSTR(-),(ii),阅读结果(发酵试验),PH,指示剂:,Phenol Red(,酚红),阳性:红变黄,-阴性对照:小杯,O,-,阳性对照:小杯,GLU(,葡萄球菌,均阳性,),橙色结果:,-在2个阳性中间:阴性结果,-在2个阴性中间:阳性结果,-在小管(红色)底部出现黄或橙:阳性结果,API 20A,-厌氧菌常存在于与氧气隔绝的标本中，如罐装食品,-常见的有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌,-厌氧菌需要特殊的培养条件,1）厌氧环境（45534、96127、96124、96118）,2）高营养(含血43041)、具还原性的培养基（41936),-可鉴定,G-、G+,球菌及杆菌86种,-厌氧菌鉴定的标准方法,API 20A,接种要领,尽快接种，减少暴露在空气中的时间,一定要将分离平板上的单个菌落用含血平板做次代纯培养。,取纯培养物小心分散于20,A Medium,使菌悬液浊度达3,MacFarland,，,避免产生气泡。,IND ARA,、ESC TRE,接满管部，,GEL,接满至杯口。,IND,液体石蜡封口。,37摄氏度、厌氧、保湿培养24,hr,API,Listeria,-,单核细胞增生李斯特氏菌是唯一致病菌,-用,于,食物卫生控制,-李斯特氏菌的鉴定标准,-唯一能鉴定所有李斯特氏菌的方法,-6个条目(,Taxa,),API,Listeria,技术要点,(,i)-DIM,试验(梅里埃独有):,分辩英诺加及单增李斯特菌,-,D,阿拉伯醇:经常(+),李斯特菌属确认,-,溶血试验:单增李斯特菌 ,HEM(+),(ii)0.5Mc(6-12,个菌落),(,iii),试条阅读,-,DIM:,加,ZYMB,试剂 3 分钟内阅读,-发酵试验,橙色:2个阳性中间=(-),橙色:2个阴性中间=(+),API CAMPY,技术要点,-保证细菌是活的,-,稳,妥起见,，,先做数个平皿的次代培养,-次代培养需 24-72小时,-麦氏比浊度,:6,-不要把培养基混进菌液,H,I,P,假阳性,-同化试验 少许变浊也被判为阳性,-先看,SUT,是阳性,，,然后再读其他同化试验结果,