血红蛋白的提取和分离2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题3 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,根据不同,生物大分子物理或化学性质的,差异，,选用一定的物理或化学的方法,进行,分离。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,一、基础知识：,凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶,又,叫分子筛）,2、概念：,根据被,分离物质的相对分子质量的大小,，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,3、原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量酸、碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,。,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液：,2作用：,能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,H,2,CO,3,/NaHCO,3,电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发,生迁移的过程。,在,“,血红蛋白,提取和分离,”,整个实验室中,使,用的缓冲液是,磷酸缓冲液,，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（,如,红色）和,对,材料的科学研究（,使其保持正常,活性）,。,2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在(),下,，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）,移动。电泳利用了待分离样品中各种分子,（）以及分子本身（）、（）的,不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,分类：,琼脂糖凝胶电泳,和,聚丙稀酰胺凝胶电泳。,如果,测定（）,通常用SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS,十二烷基,磺,酸钠,，其作用有:,使蛋白质变性并解聚成单条肽链；与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物从而掩盖蛋白质的电荷差异。,蛋白质相对分子质量,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入(),。,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，,因此测定的结果只是(),。,SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所,带,负电荷,的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它,所带静电荷的多少,以及,分子的大小,等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,电泳检测结果,琼脂糖凝胶电泳,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。,（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。,（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。,（4）纯度鉴定：通过SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人,的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,1.样品,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐,磷脂,葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（）,两个a肽链,两个,一,肽链,共四条肽链,90,每条肽链环绕一个,亚铁血红素,基团，可携带,一分子氧或一分子二氧化碳,。血红蛋白因含,血红素,而呈现红色。,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：,(,目的是去除杂蛋白,(血浆蛋白）,。,采血时,要加入柠檬酸钠防止血液凝固；,低速短时,离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；,红细胞液,用生理盐水,搅拌后低速短时离心,洗涤,三次（上清液不呈黄色为止）,。,红细胞的洗涤,思考,洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？,【提示】,生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。,2、血红蛋白的释放：,通过充分搅拌，,在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放,出血红蛋白。,思考,在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？,【提示】,(1),加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。,(2),细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。,3、分离血红蛋白溶液：,把搅拌好的混合液高速长时离心后,将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体。,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,(二)粗分离,透析：,(,1,),原理：透析袋（半透膜）能使小分子自由进出，而将大分子物质（蛋白质）则保留在袋内。,(2),目的：将样品中分子较小的杂质除去。,(,3,),方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入一定量适宜浓度的,磷酸缓冲液（PH为7.0）,中，透析,12 h,.,透析过程,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端,。,注意事项,：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,A、材料：,交联葡聚糖凝胶（G-75）。,B、代表意义：,“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B、装填：,将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意,装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,。,洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的,磷酸缓冲液（pH为7.0）,充分洗涤平衡,12小时，使凝胶装填紧密,。,注意：,1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。,2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象,。,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗入凝胶床加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱：,小心加入,pH=7.0,的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,注意：,正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、使吸管管口沿管壁环绕移动。,（三）纯度鉴定,使用最多的是SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳。,（SDS十二烷基磺酸钠）,电泳后，可以通过和标准蛋白电泳结果比对，判断纯度（和相对分子质量）。,练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是,A 弄清各种蛋白质的空间结构,B 弄清各种蛋白质的功能,C 弄清各种蛋白质的合成过程,D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是,A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质,B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质,C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质,D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A 电荷的多少 B 分子的大小,C 肽链的多少 D 分子形状的差异,4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是,A 调节pH B 维持红细胞的能量供应,C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O,2,分子数或者CO,2,分子数分别是,A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1,6、记住样品处理中的血红蛋白,释放后,溶液离心分层顺序,自上而下,是：,有,机溶剂-,脂,类物质-,血,红蛋白溶液-,红,细胞破碎物沉淀,