层析分离纯化技术-课件.ppt

Klicka hr,Klicka hr fr att ndra format p bakgrundstexten,Niv tv,*,层析分离纯化技术,2001.11.28,Shanghai,Pudong,1,蛋白质纯化策略,融合蛋白质,非融合蛋白质,表达,简单纯化,一步 亲和层析,90-97%,纯度,更高纯度,三步纯化策略,粗提,中度纯化,精细纯化,多步纯化,2,简易纯化选择,载体和标记纯化,pGEX,谷胱甘肽,S-,转移酶,GST,MicroSpin,Purification Module,GSTrap,Glutathione Sepharose,Fast Flow,PQE6 x,组氨酸,His,MicroSpin,Purification Module,pETHisTrap,HiTrap,Chelating,6 x,组氨酸,Chelating,Sepharose,Fast Flow,pEZZ,18(,非诱导性表达)蛋白,A,的,IgG,结合区,IgG Sepharose,6 Fast Flow,pRIT2T(,利用温度改变诱导,),蛋白,A,的,IgG,结合区,IgG Sepharose,6 Fast Flow,3,GST,融合蛋白的纯化,GST,重组蛋白,酶切位点,Factor Xa:,M,r,17-20 000/28-30 000,Thrombin,:,M,r,37 000PreScission Protease:,M,r,46 000,Glutathione Sepharose,M,r,26 000,10,C,4,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料一次可纯化,GST,注意融合蛋白的量,GST MicroSpin 400 g,立即可用,预装柱,Purification Module,缓冲液和试剂,和,MicroPlex 24 Vacuum,结合使用可以大大增加处理量(一次处理,48,样品),GSTrap 1 ml10-12 mg,立即可用,预装柱,GSTrap 5 ml50-60 mg,立即可用,预装柱,Glutathione Sepharose 4B8 mg,/,ml,可自行装柱,Glutathione Sepharose 410-12 mg/ml,可自行装柱，使用层析系统快速纯化，,Fast Flow,适合放大,5,GST MicroSpin Purification Module,立即可用,50 预装柱含缓冲液和所需试剂,可纯化每柱 400,g,体积达400,l,样品,适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化,6,GSTrap,柱,20,分钟内,每,1,ml,柱 12,mg,或 每 5,ml,柱,60,mg,使用针筒，蠕动泵，或者,KTA,系统,添加剂兼容,适合快速和重复性高的要求,7,GSTrap,结合缓冲液平衡,加样后用结合缓冲液冲洗,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱,收集组份,3,min,5-15,min,2,min,8,GSTrap,SDS PAGE analysis,0,20,40,60,80,100,%,Elution,buffer,0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,5.0,10.0,15.0,20.0,ml,min,Wash,Elution,buffer,2.7,mg,pure GST,fusion,protein,5.0,10.0,15.0,20.0,A,280,kD,94,14.4,20.1,30,43,67,1 2 3,柱:,GSTrap 1 ml,样品:,8,ml,大肠杆菌表达含,GST,融合蛋白胞浆萃取液,结合缓冲液:,PBS,pH 7.3,洗脱缓冲液,50,mM Tris-HCl,pH 8.0 10 mM,还原谷胱甘肽,流速:,1,ml/min,层析 步骤:,4,CV,结合缓冲液,8,ml,样品,10,CV,结合缓冲液,5,CV,洗脱缓冲液,5,CV,结合缓冲液,(,CV=,柱体积),系统:,KTAexplorer 10,1:,低分子量标记(,LMW)Calibration kit,还原,Amersham Pharmacia Biotech,2:,胞浆萃取液,1,g/10 ml,3:,洗脱,GST,融合蛋白,9,Glutathione Sepharose Fast Flow,适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大,每毫升填料可以纯化,12 mg,融合蛋白,装在,XK,空柱中和,KTA,平台纯化系统连接使用,高流速,兼容尿素，盐酸胍等,10,GST,融合蛋白的检测,检测方法注意,GST 96,孔板,ELISA,检测试剂盒适合筛选表达系统和层析组份,当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度,时特别有用,GST,酶测定检测模组,快速测定；适合筛选用途,功能测定,可以有效评估纯化出来的,GST,融合蛋白,的活性,，,但可能需要自行设计和优化,11,GST,融合蛋白的检测,检测方法注意,使用抗-,GST,抗体和,高度特异,只检测,GST,融合蛋白,ECL,检测系统的使用适当浓度的二级,HRP标记抗体可以,免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉,ECL,检测系统提高免疫印迹的检测能力,ECL,提供大部分重组表达应用所需的灵敏,度需要更高灵敏度时使用,ECL Plus.,SDS-PAGE Coomassie,提供分子量大小和,%,纯度讯息.考马氏染色或银染,可检测融合蛋白和污染物.,12,GST 96-,孔板,ELISA,检测试剂盒,快速酶测定,每块板可检测 50 样品,适合筛选表达系统和层析组份,13,(,His),6,融合蛋白的纯化和检测,重组蛋白,His,His,His,Ni,2+,His,His,His,His,Ni,2+,Ni,2+,Ni,2+14,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料一次可纯化,注意融合蛋白的量,His MicroSpin 100 g,立即可用,预装柱,Purification Module,缓冲液和试剂,和,MicroPlex 24 Vacuum,结合使用可以大大增加处理量(一次处理,48,样品),HiTrap Chelating 1 ml 12 mg,立即可用,预装柱,HisTrap Kit 12 mg/,柱含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液,HiTrap Chelating 5 ml 60 mg,立即可用,预装柱,Chelating Sepharose Fast Flow,12,mg/ml,自行装填到空柱和放大用,15,His MicroSpin,纯化模组,立即可用,50 预装柱连缓冲液和试剂,每柱可纯化达 100,g,体积达 400,l,样品,适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化,16,HisTrap Kit,每根,HiTrap,Chelating,金属螯合柱可在少於,25,分钟中纯化 12,mg,融合蛋白,包含所需浓缩缓冲液和工具,使用针筒，蠕动泵，或者,KTA,系统,添加剂兼容,快速，重复性好和容易使用,17,HiTrap Chelating,准备柱子 用,H,2,O,洗,加,NiSO,4,再用,H,2,O,洗,加样,用平衡缓冲液冲洗柱子,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白,收集组份,3,min,5-15,min,2,min,用平衡缓冲液平衡柱子,废液,3,min,18,HiTrap Chelating,SDS PAGE,Flo,w through,加样,结合液,洗脱液,结合液,A,A,280,280,A,A,405,405,1.0,0.5,0.0,0.70,0.60,0.50,0.40,0.30,0.20,0.10,0.0,5.0,10.0,15.0,20.0,Volume(ml),Eluted,pool,W,ash,kDa,94.0,67.0,43.0,20.1,14,4,1 2 3 4 5 6 7 8,样品:,5,ml,大肠杆菌表达含,(,His)-,标记,谷胱甘肽转移酶，,GST-(His),6,柱,:,HiTrap Chelating 1 ml,加,Ni,2+,结合缓冲液,:,1,X,磷酸缓冲液,20,mM,咪唑,pH 7.4,洗脱缓冲液:,1,X,磷酸缓冲液,500,mM,咪唑,pH 7.4,流速:,2,ml/min,312 cm/h,结果:,洗脱,GST-(His),6,4 ml,A,280,:1.65,总量:4.46,mg,1:,低分子量标记(,LMW),2:,样品稀释,1:20,3:,穿透稀释,1:10,4:,冲洗液,5:,洗脱,GST-(His),6,稀释,1:20,6:,洗脱,GST-(His),6,稀释,1:10,7:,GST,标准品0.5,mg/ml,8:,LMW,19,Chelating Sepharose Fast Flow,适合自行装柱和放大,每毫升填料可纯化高达 12,mg,融合蛋白,装在,XK,空柱中和,KTA,平台纯化系统连接使用,高流速,兼容添加剂,20,检测(,His),6,融合蛋白,检测方法注意,ELISA,测定标记,IgG,高特异性，只检测,(,His),6,融合蛋白,功能测定可有效评估纯化出来的,(,His),6,融合蛋白是否具备活性,不一定能买到,可能需要自行设计和优化,21,检测(,His),6,融合蛋白,检测方法注意,使用抗-,His,抗体和,高度特异,只检测,(,His),6,融合蛋白,ECL,检测系统的使用适当浓度的二级,HRP标记抗体可以,免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉,ECL,检测系统提高免疫印迹的检测能力,ECL,提供大部分重组表达应用所需的灵敏度需要更高灵敏度时使用,ECL Plus.,SDS-PAGE Coomassie,提供分子量大小和,%,纯度讯息.考马氏染色或银染,可检测融合蛋白和污染物.,22,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,(1/3),如果有对应配基，使用亲和层析,一步纯化,高灵敏度,高载量,23,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,(2/3),立即可用的,HiTrap,柱,应用 预装柱,抗体分离,所有来源的,IgG，,其亚族，和片断,HiTrap Protein A,和,HiTrap rProtein A,包括人源,IgG,3,，,小鼠,IgG,1,和大鼠,IgGHiTrap Protein G,的,IgG，,其亚族，和片断,腹水，血请，体液，和细胞培养液的,MAbTrap GII(HiTrap Protein G column(1 ml),单克隆和多克隆,IgG,工具,浓缩缓冲液),鸡蛋请的,IgY HiTrap IgY,单克隆和人源,IgMHiTrap IgM,24,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,(3/3),立即可用的,HiTrap,柱,应用：,基团特异填料,预装柱,白蛋百,多种核酸依赖酶,HiTrap Blue,凝血因子,DNA,结合蛋白,a,2,-,巨球蛋白,外露氨基酸,:,His(Cys,Trp),HiTrap Chelating,的蛋白和多肽,e.g.,a,2,-,巨球蛋白和干扰素,生物素和含生物素物质,HiTrap Streptavidin,凝血因子,脂蛋白酶，,HiTrap Heparin,胆固醇受体,激素,DNA,结合蛋白,干扰素,蛋白质合成因子,活化好的亲和柱自行挂上配基,HiTrap NHS-activated,偶连一级氨基,25,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,准备配基(,e.g.,抗体),准备柱子(,e.g.NHS-activated,HiTrap,),现成方法,优化结合和洗脱条件,使用针筒，蠕动泵，或者,KTA,系统操作的,HiTrap,小柱,制作一支特异亲和纯化柱,26,其他融合 或 非融合蛋白的检测,生物活性,Native PAGE,IEFMS,分子大小,蛋白质酶切,SDS-PAGE,免疫印迹,MS,N-,端测序,聚合物,差异性,pH,稳定性,离子强度,蛋白质和 清洁剂浓度,结构变异,N-,端差异,27,去处小分子,纯化后,(,His),6,融合蛋白的咪唑,酶切后的,GST,或,His,标记,多余的盐/,尿素/盐酸胍,用,HiTrap Desalting,将样品转移到另一种缓冲液中，,e.g.,储存用或改变,pH,28,交换缓冲液和去盐的柱子,快速有效,高处理量,去盐,交换缓冲液,去掉低分子量物质,柱子样品体积样品洗脱体积,MicroSpin G-25 0.1-0.15 ml0.1-0.15 ml,HiTrap Desalting0.25-1.5 ml1.0-2.0 ml,HiPrep 26/10 Desalting2.5-15 ml7.5-20 ml,29,交换缓冲液和去盐的柱子,HiTrap,Desalting,咪唑在盐峰中一并被去除,0,0.05,0.10,0.15,AU,280,nm,UV 280 nm,电导,(,His),融合蛋白,盐峰,6,注射,(,His),6,融合蛋白,30,选择纯化设备,纯化需要,MicroSpinSyringe+KTA,系统+,PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns,快速，高处理量筛选,(,GST or(His),6,融合蛋白),非常快速，一步纯化,(适合大部分融合蛋白),一步纯化,(,适合大部分融合蛋白,),优化以提高纯度,常规实验，重复性好,纯化后蛋白复性,31,选择纯化设备,多步纯化(非融合性蛋白或需要更高纯度,),工艺开发和优化,法规需要,e.g.GLP/GMP,纯化工艺放大,转移工艺到更大规模,使用,KTA,FPLC,或,KTAexplorer,系统:,32,大肠杆菌包涵体表达,(,His),6,融合蛋白的扩增，纯化和复性,详细步骤,33,过程,细胞培养,收获细胞,细胞破碎,离心,5-10 000g,沉淀物,冲洗和离心,分离包涵体,HiTrap Chelating,Ni,2+,纯化和复性,溶解,34,每,100,ml,培养液重新悬浮细胞沉淀物於,4,ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0,在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在,+4,C,下高速离心,10,分钟,重新悬浮细胞沉淀物於,2,ml,含,e.g.urea,的冲洗缓冲液和再度超声震荡,并在,+4,C,下高速离心,10,分钟,用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物,包涵体-细胞破碎,冲洗和分离,2,M UREA,20,mM Tris HCl,2%,Triton X100,0.5,M NaCl,35,溶解和准备样品,重新悬浮细胞沉淀物於,5,ml,溶解缓冲液(,e.g.):,20 mM Tris-HCl,0.5 M NaCl,5 mM,咪唑,6,M,盐酸胍,1,mM 2-,巯基乙醇,pH 8,在室温等 30-60 分钟,在,+4C,离心 15 分钟,用 0.22,m,或 0.45,m,濾膜过滤,36,准备,HiTrap Chelating,柱,冲洗 5,ml H,2,O,加 0.5,ml 0.5 M NiSO,4,冲洗 5,ml H,2,O,用 5-10,ml 20 mM Tris-HCl,5 mM,咪唑,6,M,盐酸胍,1,mM 2-,巯基乙醇,pH 8,结合缓冲液洗柱,最,多,5,分钟,37,纯化和复性,稀释样品,用,10 ml,结合缓冲液洗柱，,5 mM,咪唑,6,M,盐酸胍,pH 8.0,上样，并以,20 mM,咪唑,6 M,尿素,pH 8.0,缓冲液洗柱,复性,线性梯度：6,to 0 M,尿素 最少 30 柱体积流速：0.1,ml/min-1 ml/min,用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积,纯化和洗脱,线性梯度:20,mM-500 mM,咪唑,10-20,柱体积,用,HiTrap Desalting,交换缓冲液去除咪唑,1.0,0.75,0.5,0.25,0,10,20,30,40,50,60,65,ml,Manually using,a syringe:,Sample loading,Gua-HCl wash,Urea wash,Start,elution,fr.,38,fr.,42,fr.,46,fr.,49,fr.,40,Start,refold-,ing,A,280,38,组份分析,1:,LMW,2:,样品,3-6:,盐酸胍冲洗物,7,8:,尿素冲洗物,1:,LMW,2-6:,组份 38-42,7,8:,组份 48,49,1.0,0.75,0.5,0.25,0,5,10,15,20,ml,A,280,kD94,6743,30,20.1,14.4,12345678,kD94,6743,30,20.1,14.4,12345678,Superdex 75 HR 10/30,SDS PAGE,PhastGel Gradient 1015,样品稀释前处理:,用,15%,SDS,30%2-,巯基乙醇,+10,mM Tris+1 mM EDTA,稀释,1:5,HiTrap Chelating 1 ml,Superdex 75 HR 10/30,39,多维蛋白质纯化,40,高效纯化策略,粗提,纯化,精细纯化,载量,速度,分辩率,回收率,41,减少处理步骤,得率(%),95%/步,90%/步,85%/步,80%/步,75%/步,0,20,40,60,80,100,1,2,3,4,5,6,7,8,步骤,42,准备工作,考虑:,纯度水平,需要量,保持生物活性,有效和经济,蛋白质特性:,稳定性,-,pH,-,离子强度,-,温度,分子量,等电点,43,pH,的重要性:蛋白质净电荷随,pH,改变,滴定曲线,蛋白质净电荷,1,2,10,稳定性范围,用阳离子交换,用阴离子交换,3,pH,不同,pH,下的分离情况,2,1,+,-,44,pH,的重要性:蛋白质净电荷随,pH,改变,流动相的,pH,选择性,V,V,V,阳离子,阴离子,pH,0,+,-,V,V,V,V,V,Abs,Abs,Abs,Abs,表面净电荷,Abs,Abs,Abs,Abs,45,样品准备,考虑:,根据蛋白质来源选择不同萃取方法,使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶,在室温以下快速处理,用缓冲液维持,pH,离子强度,目的:稳定样品,46,三步纯化策略,Step,纯度,粗提,中度纯化,精细纯化,样品准备,萃取,净化,达到最高纯度,去除大部分杂质,分离,浓缩,和稳定样品,47,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,层析填料的,颗粒大小,中度纯化,48,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,流速,中度纯化,49,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,分辩率,中度纯化,50,粗提,目的,纯化粗样,快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶),最适用层析技术:离子交换/疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,51,粗提:离子交换填料,预装柱 20,ml,颗粒大小流速,HiPrep 16/10 Q XL&SP XL,90 m 10 ml/min,HiPrep 16/10 DEAE&CM,90 m 10 ml/min,Sepharose,Big Beads,STREAMLINE,Sepharose,Fast Flow,52,粗提:疏水层析填料,高载量,高流速,HiPrep 16/10 Phenyl(,高&低取代),HiPrep 16/10 Butyl,HiPrep 16/10 Octyl,HiTrap,HIC,选择试剂盒,放大,53,中度纯化,目的,去除大部分杂质,最适用层析技术:离子交换/疏水层析,HiLoad,离子交换和疏水层析预装柱,分辩率,快速,回收率,载量,54,中度纯化:离子交换填料,Sepharose HP 34 m,Q&SP,150,cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE,30 m,Sepharose,High Performance,SOURCE,30,Q&S,25,mg,上样载量,3,m:Mini,Q&S,Mini Beads,Q&S,2,mg,上样载量,60,精细纯化:离子交换和疏水层析填料,RESOURCE,15 m,Q,S,Phenyl,Ether,Isopropyl,1 ml,预装柱流速高达,10 ml/min,RESOURCE HIC Test Kit,61,精细纯化:反相层析填料,Sephasil,RPC,SOURCE RPC,硅胶,3,m,C2/C18,聚苯乙烯,/,二乙烯基苯,120,:,肽类,C4,C8,C18,5,and 12 m,硅胶,100,:,肽类,300 :,蛋白质,pH 1-12(14),肽类,5,15,and 30 m,62,Source,30,m,15,m,5,m,离子交换/疏水层析/反相层析,反相层析,离子交换/反相层析,63,适用於三步纯化策略的层析技术,蛋白质性质层析技术,净电荷离子交换,(,IEX),大小凝胶过滤,(,GF),疏水性疏水层析,(,HIC),反相层析,(,RPC),生物辩识(配基特异性)亲和层析(,AC),配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(,EBA),疏水性,有,AC,IEX or HIC,64,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,主要特色,粗提,中度纯化,精细纯化,IEX,高分辨率,高载量,快速,HIC,分辨率好,载量一般,快速,AC,高分辨率,高载量,快速,GF,高分辨率,RPC,高分辨率,65,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,样品起始状态,样品结束状态,IEX,低离子强度,高离子强度或,pH,改变,样品体积不受限制,样品被浓缩,HIC,高离子强度,低离子强度,样品被浓缩,AC,特异性结合,特异性洗脱条件,样品体积不受限制,样品被浓缩,GF,样品体积受限制,交换缓冲液,(2 M,(NH,4,),2,SO,4,容易氧化,77,DAOCS-,一般准则,在所有缓冲液中加,DTT,使所有半胱氨酸残基保持还原状态,加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性,用,SDS PAGE,检查每一个组份中,DAOCS,利用酶测定法测量生物活性,78,准备样品,悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中,超声震荡破碎细胞,DNA,沉淀,利用离心沉淀,来源:从,S.,Clavuligerus,克隆得到的,DAOCS,基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增,79,选择粗提的层析技术,阴离子交换:快速,浓缩,样品处理最简单,分离基础:电荷,因为,DACOS,的,酸性,pI,和不稳定性，所以缓冲液选择中性,pH,80,粗提-在,KTA,FPLC,上优化梯度,线性梯度,步级梯度,优化梯度,层析柱:HiPrep 16/10 Q XL,系统:,KTA,FPLC,0,10,20,30,min,0,100,200,300,100,200,300,400,0,0,20,40,60,80,mAU,ml,mS/cm,0,100,200,1000,2000,3000,0,0,20,40,60,80,mAU,ml,mS/cm,0,10,20,min,0,100,200,1000,2000,3000,0,0,20,40,60,80,mAU,ml,mS/cm,0,10,20,min,81,选择中度纯化技术,HIC:,分离基础:疏水性,蛋白质疏水性质很难预测:筛选适合填料,HIC,可以跟,IEX,互补衔接,减少样品处理步骤(只需要加盐),DAOCS,在高盐下能保持稳定,82,选择精细纯化的层析技术,GF:,分离基础,:,分子量差异,GF:,最适合分离双体，寡聚体和聚合物,83,DAOCS-,优化好的粗提步骤,层析柱:,HiPrep 16/10 Q XL,系统:,KTA,FPLC,浓缩样品,快速去除有害物质,0,100,200,1000,2000,3000,0,0,20,40,60,80,mAU,ml,mS/cm,84,DAOCS-,优化好的中度纯化步骤,层析柱:,SOURCE 15ISO,内径 16,mm,长度 50,mm,系统:,KTA,FPLC,HIC,和,IEX,互补,浓缩样品,除去大部分杂质,0,100,200,100,200,300,400,0,ml,A,280,nm,85,DAOCS-,优化好的精细纯化步骤,层析柱:,HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade,系统:,KTA,FPLC,去除聚合物和余下的少量污染物,交换缓冲液,0,80,60,40,20,100,200,400,600,800,1000,0,ml,mAU,86,DAOCS-,用,SDS-PAGE,分析,4,3,2,1,M,M,M-LMW,低分子量标记,1-,样品,2-,组份-,Q Sepharose XL,3-,组份,-SOURCE 15ISO,4-,组份,-Superdex 75 pg,67,k,43k,30,k,87,DAOCS,纯化-结果,粗提,中度纯化,精细纯化,0,80,60,40,20,100,200,400,600,800,1000,0,ml,mAU,0,100,200,1000,2000,3000,0,0,20,40,60,80,mAU,ml,mS/cm,0,100,200,100,200,300,400,0,ml,mAu,88,DAOCS,纯化-结果,DAOCS,的高分辨电子密度图谱,结晶,DAOCS,的,X-,射线绕射图,感谢瑞典农业科技大学的,Prof.Inger Andersson,和,Dr.Anke Terwisscha van Scheltinga,以及瑞典,Uppsala 大学生化系的,Dr.Karin Valegrd,提供以上图片,89,中度纯化,DAOCS,纯化-总结,工艺,优化,快速探索填料(,scouting),快速探索梯度(,scouting),快速探索填料(,scouting),快速探索梯度(,scouting),优化好的纯化流程,样品准备,HiPrep,16/10 Q XL,SOURCE 15ISO,HiLoad,16/60,Superdex,75 prep grade,粗提,精细纯化,浓缩,60,分钟,30,分钟,40,分钟,120,分钟,80,分钟,时间,浓缩,90,KTA,平台层析系统纯化,DAOCS,-结论,DAOCS,纯度足够进行结晶,使用,KTA,平台层析系统的模板和快速探索(scouting)功能可以快捷有效地优化纯化工艺,纯化时间从,3,天减少到 6 小时,91,请参考中文网站,92,谢谢,欢迎您随时和我们联系,support,北京(010)6487 3549上海(021)5080 0260广州(020)8732 0255香港(852)28117575,93,