基因工程操作技术修改上课版.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,补：原核细胞的基因结构,非,编码区,非,编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,不能转录为信使,RNA,，,不能,编码蛋白质。,：能转录相应的信使,RNA,，,能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显,子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的,RNA,聚合酶结合位点。,非,编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由,能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,是编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2,、获取目的基因的常用方法有哪些,?,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,如苏云金芽孢杆菌的,抗虫基因,，还有植物的,抗病（抗病毒、抗细菌）基因,、,种子贮藏蛋白的基因,，以及人的,胰岛素基因、干扰素基因,等。,是人们所,需要转移,或,改造,的基因,(,一,),、从基因文库中获取目的基因：,基因文库,:,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库,(gene library),基因组文库,:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库,.,部分基因文库,:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,.,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,:,cDNA,文库）,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢,?,2.,基因文库的构建方法,鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),(,一,),从基因文库中获取目的基因,反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，,然后在酶的作用下合成双链,DNA,，,从而获得所需的基因。,目的基因的,mRNA,杂交双链,(,单链,RNA/,单链,DNA),单链,DNA,反转录酶,核酸酶,H,2.,基因文库的构建方法,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,目的基因,),根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法,：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使,RNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,2.,基因文库的构建方法,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考,:,为什么要构建基因文库,?,直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗,?,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,、,_,、,_(,做启动子,),、,_.,前提条件。,原理：,_,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成,百万倍地扩增,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-9,5,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,_,断裂，形成,_,b,、,退火,（,复性,5,5-6,0,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、,延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从引物的,5,端,3,端,延伸，合成与模板互补的,_,。由,1,个,DNA,分子复制得到,2,个,DNA,分子,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,d,、,重复循环多次，得到,个,DNA,分子,2,n,目的：,所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么,?,(,二,),基因表达载体的构建,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,基因表达,载体的,组成：,1.,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,2.,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,(,二,),基因表达载体的构建,核心,3.,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组DNA,分子（重组质粒）,核心,同一种,(,二,),基因表达载体的构建,4.,过程,:,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,(,三,),将目的基因导入受体细胞,(,三,),将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,(,三,),将目的基因导入受体细胞,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,（,1,）农杆菌介绍,（,2,）原理及适用范围,分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，根瘤农杆菌广泛存在于双子,叶植物中。约有,93,属,643,种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子,植物对该菌也敏感。单子叶植物一般对该菌不敏感。,植物基因工程以根瘤农杆菌的,Ti,质粒介导的遗传转化最多。,根瘤农杆菌具有趋化性，即植物受伤组织会产生一些糖类和,酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。这些物质主要,在双子叶植物的细胞壁中合成，一般不存在于单子叶植物中。,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：,显微注射法,(,三,),将目的基因导入受体细胞,3,、将目的基因导入微生物细胞,（,1,思考：为什么选用微生物作为受体细胞？,（,2,）方法：,将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是,:,首先用,Ca,2+,处理细胞,以,增大,细菌,细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态,这种细胞称为,感受态细胞,。,第二步 是将重组表达载体,DNA,分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子,完成转化过程。,第三步,目的基因在受体细胞内，随其繁殖而,复制,，,由于细菌,繁殖的速度,非常快，在很短的时间内就,能获得,大量,的目的基因。,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定,等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,DNA,分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链,DNA,解开，把单股的,DNA,小片段用,同位素、荧光分子或化学发光催化剂,等进行标记，之后同被检测的,DNA,中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的,DNA,或基因。,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库获取,利用,PCR,获取,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法等,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,1,）以下说法正确的是 （）,A,、,所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B,、,质粒是基因工程中唯一的运载体,C,、,运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D,、,基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2,）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、,能复制,（）,B,、有,多个限制酶切点,C,、,具有标记基因,D,、,它是环状,DNA,D,练习,3,）有关基因工程的叙述中，错误的是,（）,A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、,限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、,目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、,人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4,）有关基因工程的叙述正确的是,（）,A,、,限制酶只在获得目的基因时才用,B,、,重组质粒的形成在细胞内完成,C,、,质粒都可作为运载体,D,、,蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5,）基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,（）,A,、,人工合成目的基因,B,、,目的基因与运载体结合,C,、,将目的基因导入受体细胞,D,、,目的基因的检测和表达,C,练习,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。,（,1,）,电击法：,借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。,（,2,）,显微注射法：,利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。,（,3,）,直接吸收法：,把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。,（,4,）,基因枪法：,在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。,间接导入法常用的载体是,质粒、,噬菌体、科斯质粒,。,（,1,）质粒是细菌染色体,DNA,以外的环状双链,DNA,分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体,DNA,中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。,（,2,）,噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链,DNA,可以作为目的基因的载体。,（,3,）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和,噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。,用口径为,1m,的,DNA,注射器,，将大量的目的基因片段注入到,受精卵的核,内，然后把经过注射的受精卵,移植,到另一只雌性动物的,子宫,内，使,受精卵发育,为转基因动物。,什么叫显微注射技术？,显微注射技术,导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,