定点单突变多突变.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,定点单突变及多突变,随着分子生物学研究的突飞猛进,基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段,在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、,PCR,介导的定点突变及盒式突变。目前,PCR,介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法,以,PCR,为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变,PCR,可以在,DNA,区段的任何位置突变,且可以在侧引物的两端设计酶切位点,方便进一步的连接克隆。我今天要举得例子是重叠延伸突变，包括两个内容：一,定点单突变。二,.,定点多突变。,一：定点单突变,1,材料和方法,1.1.,材料：,Pyrobest,TaqDNA,Polymerase,、,dNTP,、,T4DNA,连接酶、限制性内切酶,Mlu,和,Bgl,及琼脂糖。,2,个含有突变碱基的反向互补的引物，,2,个分别与,DNA,两端互补的上下游通用引物：,引物,1:5GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3,，引物,2:5GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3,，,引物,3:5 ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3,，引物,4:5GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3,，,1.2.,方法：,2,.,1,正常人,TGF-2,基因,-270bp,+280bp,启动子区,报告基因的构建。,1,.,2,.,2,人,TGF-2,基因启动子区突变体基因的构建。,整个诱变过程需要两次,PCR,，第一次,PCR,进行两个反应，分别得到,5,端和,3,端重叠的两个,DNA,片段。两个,PCR,反应的产物混合变性、复性，含有重叠部分,DNA,片段可以配对，在,DNA,聚合酶的作用下延伸，产生完整的双链。用上下游通用引物进行第二次,PCR,，扩增含突变位点的完,DNA,。操作过程如图,1,1,所示。,第一次,pcr,：分别利用两对引物进行常规,pcr,，产生两个,DNA,片段。两个,pcr,片段有一段的重叠，即互补配对，且突变位点位于重叠序列中间位置，进行跑胶。第二次,pcr,：纯化回收后，两个片段混合作为模板分别利用引物,1,和引物,2,进行,pcr,，变性后的两个片段将在重叠区域退火,进而延伸形成全长。进行跑胶。,1.3.,克隆及测序：,反应结束后,将,PCR,产物进行回收,经酶切、连接、转化等步骤后克隆到,pGL3-Basic,报告基因载体中,送上海生物工程公司测序。看单位点突变是否成功。,结果：,重叠延伸,PCR,扩增人,TGF-2,基因启动子区,-114bp,区突变基因,和,分别为,5,端带有突变位点的短片段,PCR,产物,是以,和,为模板进行延伸并扩增得到的带有突变位点的,564bpPCR,产物,见图,1,。,2.,定点多突变：,下面举一个双突变的例子：与单突变不同，双突变需要六个引物，两个通用引物，以及四个定点突变引物：方法看图,2.,结果：,图,2,各阶段,PCR,产物电泳图,M:DL2000 DNA,分子量标记,;1:985bp,片段,;2:578bp,片段,;,3:uORF1Mu(,由,985bp,片段、,578bp,片段重叠延伸而来,长,1534bp);4:1101bp,片段,;5:459bp,片段,;6:uORF2Mu(,由,1101bp,片段、,459bp,片段重叠延伸而来,长,1534bp),