1、实验16油菜的花药培养,了解和学习油菜花药培养技术。,一、目的,油菜花药培养是获得单倍体的重要途径。如果利用杂种一代的花药培养，可将杂种一代的异质配子培育成单倍体小植株，经染色体加倍形成双单倍体纯合个体，经选择可以获得优异的材料，从而可缩短育种周期，提高育种效果。此外，花药培养可克服远缘杂种的不育性，可以在细胞水平或单倍体水平上作诱变处理，也能提高育种效果。,二、内容说明,油菜花药培养有以下步骤：,（1）花粉发育时期的选择，,（2）诱导花药产生愈伤组织，,（3）诱导愈伤组织进行器官分化，,（4）小植株的移栽，形成花粉植株。,二、内容说明,1、用品：显微镜，培养皿，镊子，记载表。,三、所需用品
2、和操作方法,（一）花粉发育时期的选择,操作台,2、主要作法：,在始花期选择油菜品种（或杂种）生长健壮的植株，取其主茎顶端蕾盘（即主花序，因花序未伸长而称蕾盘）或植株主茎上往下数5个第一次分枝顶端的蕾盘2-3个。每个蕾盘大致可分为三圈，外圈有15-25个花蕾，中圈有10-15个花蕾，内圈即花盘中间的一撮蕾。,据研究，油菜花药培养以取中圈花蕾最适宜，相应于此时期的花粉时期为单核期至双核期。,（一）花粉发育时期的选择,2、主要作法,（续）,：,分别取油菜主茎顶端花盘外、中、内圈花蕾，用醋酸地衣红或醋酸胭脂红涂抹制片，在显微镜下观察花粉发育时期，并接种在,Miller,培养基上，观察不同部位花蕾的花药
3、产生愈伤组织百分率，填入表16-1中。,（一）花粉发育时期的选择,2、主要作法,（续）,：,表16-1 不同部位花蕾花粉发育时期和产生愈伤组织百分率,（一）花粉发育时期的选择,取蕾部位,花粉发育时期,接种花药数,愈伤组织数,产生愈伤组织百分率,外圈,50,中圈,50,内圈,50,1、用品（,见下图,）：,镊子，小烧杯，接种针，75%酒精，新鲜的饱和漂白粉上清液或0.1%升汞溶液，蒸馏水，无菌水，超净工作台（或接种箱），酒精灯，各种有关培养基（见表16-3），50,ml,三角瓶，培养室。,（二）诱导花药产生愈伤组织,用品,2、主要作法：,（1）花药的接种。,用肥皂洗净双手，再用75%酒精擦洗，然
4、后用75%酒精擦拭花盘，在超净工作台取花蕾浸入饱和漂白粉上清液或0.1%升汞溶液中浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗2-3次。,用镊子将花药取出投入装有培养基的三角瓶中，每三角瓶接种30个左右花药。,接种后用棉花塞塞好，用记号笔写上接种材料、日期。,（二）诱导花药产生愈伤组织,2、主要作法,（续）,：,（2）愈伤组织的诱导,诱导花药产生愈伤组织用的培养基一般采用,Miller,培养基+2，4-,D 1mg/L+,激动素1.5,mg/L。,将接种到诱导培养基上的花药置于23-28的恒温室内进行暗培养。,接种后4-5天花药大部分变成浅棕色或深棕色，5-10天开始产生愈伤组织，陆续可延至二个月之久。
5、观察记载愈伤组织长出的部位和数量。,（二）诱导花药产生愈伤组织,1、用品,MS,培养基，6苄基嘌呤，激动素，吲哚乙酸，培养室，小花钵，无土培养物。,（三）诱导愈伤组织进行器官分化与移栽,培养室,2、主要作法,（1）诱导愈作组织器官分化的培养基。,一般采用,MS,培养基补加2,mg/L6,苄基嘌呤和3,mg/L,激动素效果很好。试比较以下不同分化培养基对花药愈伤组织分化的影响，将结果填入表16-2。,（三）诱导愈伤组织进行器官分化与移栽,培养基,表,16-2,不同分化培养基对油菜花药愈伤组织分化的影响,分化培养基组成（,mg/L）,愈伤组织块数,愈伤组织分化苗数,分化百分率（%）,MS+,激（
6、2）+吲（0.2）,50,MS+,激（4）+吲（0.2）,50,MS+,激（3）,50,MS+,激（10）,50,MS+,苄（1）,50,MS+,苄（2）,50,（2）管理,当愈伤组织长到2-3,mm,大小时，转移到诱导器官分化的培养基上，置于23-28恒温室内，每天光照9-11小时，光强2000,Lx,以上。,这样愈伤组织1-3周后可见绿，再过2-3周可见到从绿点抽出一丛或一片小叶。而在愈伤组织其它部分长出根的突起，随即叶片伸展。,有时根发生稍迟，在叶伸展时才出现根的突起或更迟，这时应转移到1/2,MS,培养基上，可长成完整幼苗。,由花药长成的愈伤组织，中间出现绿点,由愈伤组织长成的叶,由愈伤组织长成的叶簇,由愈伤组织长成的叶,经花药长成的小苗,经花药长成的小苗,（3）幼苗移栽,待分化好的幼苗3-4片叶时即可移栽。,移栽前先将根部的培养基冼净，然后栽入装有无土培养物的小花钵中，开始需用烧杯罩住幼苗，防止水分蒸发而死苗，待成活后取掉烧杯子。,（三）诱导愈伤组织进行器官分化与移栽,移栽成活的小苗,1、在油菜花药培养中，以哪个花粉发育时期花药最好，为什么？花蕾大小与花粉发育时期有无相关性？,2、哪种分化培养基的效果最好？在不同分化培养基上长出的幼苗在形态上是否一致？为什么？,3、如何提高油菜幼苗移栽成活率？有哪些关键环节？,四、作业,
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