第三章基因突变.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 基因突变,本章内容,突变类型与基因符号,基因突变的规律,诱变机制,自发突变的机制,突变诱发的影响因素,致癌物质的检测,诱变育种与突变型的选育,第一节 突变类型与基因符号,广义的“突变”，包括两大类：,基因突变,（又称,点突变,）,染色体畸变,狭义的“突变”，专指基因突变（点突变）。,只涉及一对或少数几对碱基的改变。,一,、,突变类型,1.,环境变异与遗传变异,（1）表型变异（环境变异）,由于生物所处的环境不同，导致表型上的差异，这种,表型只在当代,，,F1,则无，是生物在一定的基因型下适应性的表现，不能遗传,。,例1：,E.,coli,的,-,半乳糖苷酶：,E.,coli,培养在葡萄糖培养基上时，不产生,-,半乳糖苷酶，,而在含有乳糖的培养基上培养，可产生,-,半乳糖苷酶，,转入葡萄糖培养基上时，则不产生,-,半乳糖苷酶。,例2：,E.,coli,在含有致死剂量的苯酚中，全部无鞭毛，,转入不含苯酚的平板上时，又产生鞭毛。,（2）遗传变异,指生物的遗传物质发生了变化，,可遗传,。,发生频率通常为10,-6,-10,-9,/细胞/世代。,如何区别两种变异？,通过观察群体变化倾向，可区别两种变异。,环境变异,：,变异,频率高,，,表现为全部个体的行为；,遗传变异,：变异,频率低,，,群体中极少数个体的行为；,（自发突变频率通常为10,-6,-10,-9,）,2.突变的表现型,从突变所带来的表型的改变，突变型可分为以下几类；,（,1）形态突变型,包括影响,细胞形态,的突变型以及影响细菌、霉菌、放线菌等的,菌落形态,以及影响噬菌体的,噬菌斑,的突变型。,（,2）生化突变型,如：孢子、鞭毛、荚膜、色泽、噬菌斑,指,没有形态效应的突变型。,最,常见的是营养缺陷型，由于代谢过程的缺陷而成为必需某种物质才能生长的突变型。,糖,分解，营养要求，代谢产物生成能力，,温度敏感(,T,s,),一般是加工,tRNA,的蛋白敏感,（,3）抗性突变型,抗药性，抗噬菌体，抗紫外线,（,4）条件致死突变型,Ts,，,抑制基因突变,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死,效应的突变型。,常用的条件致死突变是,温度敏感突变,，用,ts,（temperaturesensitive）,表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如,25-30）下得到这种突变。,3.染色体畸变的特点,缺失,染色体缺失造成的遗传学效应一般不同于基因突变：,不能发生回复突变,；,通常,相邻的几个基因同时发生突变,；,重复,在染色体上增加一染色体片段，使某些基因重复出现。一个最明显的效应是,基因剂量效应,，可,通过基因产物的测定而检出,。,倒位,一部分染色体的顺序颠倒。,易位,相互易位指,两个非同源染色体相互交换一个部分。,产生,半数不育配子/子囊孢子,（脉孢菌）。,不同于转座。转座是一段可进行自我复制，转移的,DNA,片段，转座可视为一种易位。,4.点突变,只,涉及,DNA,分子中1对或少数几对碱基的改变。,这种,DNA,结构变异是可以遗传的，通常引起一定的表型变化。,从遗传物质的结构改变，可分为：,基因突变,（点突变）,碱基置换,移码突变,转换,颠换,增加,缺失,（2）按突变所引起的遗传信息的改变（,碱基置换突变的效应）可把突变分为三种：,同义突变,碱基突变后编码的氨基酸与野生型的氨基酸相同。（密码子是简并的）；,错义突变,突变造成一个氨基酸的置换。错义突变表型不一样，看是否影响蛋白质的二级、三级结构。,无义突变,碱基突变后形成终止密码子,，,使蛋白质合成提前终止。,无义密码子,：,UAG：,琥珀,密码,（,amber）,；,UAA：,赫色,密码,（,ocher）,；,UGA：,半透明,密码,（,opal,或,umber）,；,GGA（,甘氨酸）,GGC（,甘氨酸）同义突变，多肽链结构不变,GCA（,丙氨酸,）,错义突变，,多肽链中的一个,氨基酸被置换，但不影响活性。,AGA（,精氨酸,）,错义突变，,多肽链中的一,个氨基酸被置换，形成无,活性的蛋白。,UGA,终止密码子，合成不完全的多肽链。,二、基因符号,每个,基因座位,用,三个小写英文字母,表示（这三个字母来自说明这一基因特性的一个或一组英文单词的前三个字母）；,产生同一突变型表型的不同基因，在三个小写字母后加一个大写字母表示；,同一基因的不同突变位点，用基因符号后所加的阿拉伯数字表示；,如突变位点所属的基因还不确定，那么大写字母用一短线表示；,1966年，,M.,Demerec,等人提出了一套,E.,coli,的,基因命名规则：,表示：,基因在染色体上位置,突变基因,表型用大写字母表示，第一字母大写，并加,+/-,，如乳糖发酵缺陷型的基因符号,lacZ,-,，,其表型符号,LacZ,-,；Amp,r,；,缺失用,表示，并写在缺失基因前面，如,lac,uvrB,（,uv,修复基因,B,缺失）；,抑制基因突变表示为,Sup,+,或,Su,+,，,野生型表示为,Sup,-,或,Su,-,（suppressor,的缩写）；,F,因子上基因采用“；”或“/”与染色体基因分开。,第二节 基因突变的规律,一、基因突变是自发的，抗性突变与环境无关,这句话有三层含义：,遗传物质自我运动的结果，是随机的；,突变多方向性；,环境可以诱发突变，但突变不必因环境要求改变，,即两者无因果关系。,抗性突变的特点：,突变的回复；,突变的发生彼此独立；,突变型具有一定的稳定性；,突变率可经诱发而提高。,S.E.,Luria,&M.,Delbruck,：,波动试验”（1943）,（根据统计学原理设计）,波动实验原理：,）适应学说预期,：,噬菌体的存在诱发了抗性细菌的出现,，把正在生长的敏感菌培养物与,T1,接触后，所出现的抗性菌的数量在任何条件下都,应该是平均值，平均值等于方差,。,）变异学预期：,抗性细菌是在接触,T1,之外的生长过程中基因自发突变的结果,，则抗性菌出现的频率将依赖于：,是否出现；,出现的早晚；而是,呈现巨大的波动，平均值不等于方差,。,1）变量实验（,fluctuation analysis）,Salvador,Luria,&Max,Delbruck,(1943,),对噬菌体,T1,敏感的,E.,coli,对数期培养物，稀释至10,3,/,mL,分装两试管，各10,mL,与甲管分装的各小管同时保温2436,h,甲管,乙管,证明：,抗噬菌体菌株的出现与接触,T1,无关；,突变是自发的，,T1,无,诱发,抗噬菌体菌株的作用，,只是起选择作用；,抗性细菌多，则突变发生的早；,抗性细菌少，则突变发生的晚；,抗性细菌无，则没有发生有关的突变。,突变发生在接触之前（突变发生的时间是随机的）,涂布实验,问题：,经重新涂布的一组平板上，抗性细菌多，是否可理解为：经重新涂布后，细菌接触噬菌体的机会增多了，从而诱发的抗性也多了？为什么？,答：,重新涂布后，接触机会没有增多，而是因为,抗性突变可以在接触噬菌体之前发生，无涂布的抗性突变型细菌形成一个菌落，涂布后可以形成若干菌落，,同时,由于突变的时间发生早晚，而使每次涂布结果不同,。在比较早的时候重新涂布，已发生突变的菌落少，涂布后，突变菌落数目也少；在比较晚的时候重新涂布，已发生突变的菌落多，涂布后，突变菌落数目也多，如果是涂布使噬菌体与菌体接触的机会增多，则无论早晚，突变菌落应差不多。,2）,Newcombe,的涂布实验（1949）,选用对,T1,噬菌体敏感的,E.,coli,，,以相等数目涂布于12个平板上,约繁殖了12.3代,在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多,3）影印实验（,replica plating）,Joshua,Lederberg,and Esther,Lederberg,（1952）,通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法,平板上的对应菌落可在含,Sm,平板上生长，其它不能。该实验反映：经过多次影印可得到少数抗性菌落，也说明抗性突变可发生在接触药物之前，突变是随机的。,二、抗性突变以一定的频率发生在个别细菌中,突变率的计算：,固体平板法,液体培养法,间接计算法,突变率：,每一细胞每一世代中发生突变的概率。,通过细菌的总数与每一世代所需的时间（生物时间）换算出世代数。细菌不分裂，不发生突变。,从一个细菌开始细菌世代数和细菌数的关系,分裂次数,n,1,2,3,4,5,细菌数,2,n,2,4,8,16,32,世代总数2,n,-1,1,1+2,=3,1+2+4,=7,1+2+4+8,=15,1+2+4+8+16,=31,细菌数与世代数的关系：,如果细菌总数和开始时的细菌数相差很大，,可认为，,细菌数=世代数,固体平板法计算突变率：,突变率=（,M,2,-,M,1,）,/（N,2,-,N,1,）,=（M,2,/N,2,）,0.69,M,1,，,M,2,：,代表培养前后出现的抗性菌落数；,N,1,，,N,2,：,代表培养前后出现的细菌总数（世代数）；,M,1,=0，N,2,N,1,一个菌落代表一个突变的事件，细菌生长不同步，需,0.69,校正。,单位：,个/细胞/世代,三、突变的其它规律（性质）,.突变的回复（可逆性）；,.突变稳定，这里指狭义的点突变，可稳定遗传；,突变具有独立性，突变的发生彼此独立无关；,.突变率可以通过各种物化因素而增加。,野生型基因变为突变型基因的过程，称为,正向突变,；,突变型基因变为野生型基因的过程，称为,回复突变,；,回复突变可由多种原因引起：,回复突变发生在原突变位点上，恢复原来的野生型碱基顺序；,移码突变引起的回复突变（缺失一个核苷酸的突变，同一基因的另一位置上一个核苷酸的插入，能抵消前一突变的作用而使后一突变位点后面的编码恢复正常）；,由抑制基因（,suppressor）,引起的回复突变；,抑制基因：,由于第二个基因的突变，消除或抑制了第一个突变基因的表型，第二个突变基因称为抑制基因，用,sup,表示。有抑制基因突变时用,+,，没有抑制基因突变时用,-,，抑制基因用来抑制无义突变。,E.,coli,中：有一个抑制基因,su3,+,，,它能使,一个无义琥珀突变型的终止密码位置上出现一个酪氨酸(,Tyr,)，,而使蛋白质合成能通过终止密码而继续进行。,mRNA,.UAG(,琥珀密码，是基因无义突变的结果),突变,tRNA,Tyr,AUG,tRNA,Tyr,AUC,突变后,tRNA,Tyr,的反密码子能识别,UAG(,琥珀密码），而把一个,Tyr,放到终止密码位置上。,这一,tRNA,基因突变型对于琥珀突变型来讲，便是一个抑制基因。,第三节诱变机制,诱变剂（,mutagen,）：,凡能提高基因突变频率的因素统称为诱变剂。,诱变剂的种类,物理诱变剂,化学诱变剂,光，热，射线（,UV，x-,射线，,射线）,从遗传物质结构变化的特点，,将化学诱变剂分为：,引起碱基置换的诱变剂,移码突变诱变剂,引起染色体畸变的诱变剂,一、碱基置换,.天然的碱基结构类似物；非标准的核酸碱基，可通过,正常的聚合作用进入到核酸中去；,.参入错误和复制错误；,.其它诱变剂。,凡是可以与,DNA,分子发生化学反应，并使其结构发生改变的物质，统称为,诱变剂,。,用诱变剂处理细胞得到突变型，则为诱发突变；用诱变剂诱发突变叫诱变。,化学诱变剂分类：,.,碱基类似物（5-,Bu，2-,Ap,）,：,非标准的核酸碱基，,能通过正常聚合作用进入,DNA,分子中；,.,碱基修饰剂（,HNO,，NH,2,OH，,烷化剂）,；,.,吖啶类,（3个环的扁平分子，大小与嘌呤-嘧啶对,大致相等，可插入到两个碱基对之间。在,DNA,分子,复制时，产生移码突变）,其中,为碱基置换诱变剂，3为移码诱变剂。,（,一）天然的碱基结构类似物,5-溴尿嘧啶（5-,Bu）,5-,BU,有两种异构体：,酮式,和,烯醇式,，可分别与,A,及,G,配对；,5-,Bu,比,T,有较多的烯醇式出现，5-,Bu,本身也是酮式占优。,T,的结构类似物，仅在第5个碳元子上由,Br,取代了甲基。,复制错误（,TA CG）,参入错误(,CG,TA,),酮式,烯醇式,几率小,烯醇式,酮式,几率大,复制错误（,TA CG）,：,在,DNA,链,复制过程中，5-,Bu,分子由酮式转变为烯醇式，而形成,G:Bu,碱基对的过程，称为复制错误。,参入错误(,CG,TA,),：,5-Bu,以烯醇式结合进,DNA,分子中，以较小概率形成,G:Bu,碱基对的过程，称为参入错误。,参入错误几率大于复制错误几率,。,上述两个错误反映出：,突变是由5-,Bu,诱发，但在突变位点上，5-,Bu,并没有,代替,T,的,位置；,5-,Bu,既可,引起正向突变，又可诱发回复突变。,5-,Bu,能引发两种,转换：,CG,TA（,更容易）,TA CG,不引起颠换,。,作用特点：,配对不严谨（既可以与,T,又可与,C,配对）；,不能发生变构；,能诱发两个方向的转换，,AT GC,AT GC（,主要）,。,（2）2-氨基嘌呤（2-,Ap,）,是,A,的结构类似物,（,1）亚硝酸（,HNO,）,A H(,次黄嘌呤,),引起,AT,GC,C,U,引起,CG AT,G X（,黄嘌呤）仍和,C,配对，不产生转换突变,（,二）碱基的化学修饰剂,通过改变碱基的结构，从而引起碱基的错配。,氧化脱氨基作用，使氨基变为酮基，,从而改变配对性质造成碱基置换突变。,A,H,A,A,T,T,T,H,H,H,C,C,C,G,次黄,嘌呤,HNO,诱变作用特点：,可作用非复制状态下,DNA；,通过氧化作用，把氨基转变为酮基可引起,AT,GC,双向转换；,（由,HNO,引起的突变可以由,HNO,引起回复突变）,（2）羟胺（,NH,2,OH）,特点：,高度特异性诱变剂，只与,C,反应,（而不与其它三种,碱基反应）；,只引起单向转换,GC AT,；,（,3）烷化剂,对于点突变的诱变作用主要是,由于,引起碱基的错误配对,。,常用的烷化剂：,硫酸二乙酯（,DES）,甲基磺酸乙酯（,EMS）,甲基磺酸甲酯（,MMS）,N-,甲基-,N-,硝基-,N-,亚硝基胍,(,NTG),氮芥、硫芥,环氧乙烷,诱发点突变和染色体畸变,两种机理：,许多烷化剂和碱基的反应产物主要是7-烷基嘌呤,嘌呤环上,N-7,位置接上烷基而形成四价氮的基团，该基团可,促进嘌呤环的离子化,，,离子化的,G,与,T,配对,，故使,GC,AT。,烷基化嘌呤，可使糖苷键发生不稳定变化，易水解，而,产生脱嘌呤部位(,O,表示),。,DNA,复制时和,O,相对的位置上可以出现任何一种碱基，从而引起转换或颠换。,烷基化,脱,嘌呤,亚硝基胍,(,NTG),作用特点：,突变频率高,（约1%）（超诱变剂）；,可,引发并发突变,（两个以上临近位置的基因同时发生突变）；,主要作用于,DNA,复制叉位置的基因,，诱变部位可随,DNA,复制叉的移动而变（因此应尽量作用于,DNA,复制的细胞，提高突变率）；,并发突变可回复，缺失突变不可回复,，可由此检验两者不同（并发突变与缺失突变的表型效应相同,）。,二、辐射,非,电离辐射（如：,UV），,可回复突变，故为点突变,辐射的诱变作用：,直接作用：直接作用于染色体,引起,DNA,骨架的断裂,，而造成畸变；,形成,嘧啶二聚体,（一般是,TT,二,聚体,）,间接作用：使细胞中染色体以外的物质发生变化，,然后这些物质作用于染色体而引起突变。,产生过氧化氢,（,H,2,O,2,）,和自由基，导致,DNA,的氧化损伤,如：超氧阴离子自由基,（,O,2,-,.,），,羟基自由基,（,OH,.,）,形成碱基类似物，诱发突变,辐射诱变的特点：,辐射有直接作用；,点突变的频率与照射剂量呈直线关系；,这些剂量关系曲线都通过原点，证明任何一点辐射都可诱发突变；,只要总剂量不变，多次照射和一次照射的效果相等，即少量多次辐射和一次大量辐射的剂量效应相同。,1.紫外线（,ultravioler,ray,UV,）,波长范围：,136390,nm,200300nm,范围对诱变最有效,（,260,nm,诱变效果最强）,紫外线诱变的作用机制：,形成胸腺嘧啶二聚体（主要）,DNA,链的断裂；,DNA,分子内或分子间的交联；,形成嘧啶水合物；,非电离辐射,胸腺嘧啶二聚体的存在，可带来,DNA,分子构形的扭曲，从而影响正常的复制和转录并从而致死，也可使,DNA,复制造成差错从而发生突变。,2.电离辐射,X-,射线：,0.060.136,nm射线,：,0.010.14,nm（,65,Co,发射）,X-,射线和,-,射线带有较高的能量，,能引起被照射物质中原子的电离，故称电离辐射。,诱变作用有两种方式：,直接作用：引起,DNA,链的断裂，,DNA,双链间的交联等；,间接作用：使细胞产生,过氧化氢和自由基，而引起突变；,3.离子束,离子注入是近年发展起来的一种新的生物诱变技术，具有损伤小、突变谱广、突变率高、并具有一定的重复性和方向性的新特点。,20世纪80年代中期，我国学者,余增亮首先,把该技术应用于,水稻诱变育种,，育成2个水稻新品种（晚梗,D,9055,和中熟早籼,S,9042,），,后来用于其它农作物，如,小麦、玉米、大豆、烟草、谷子等的诱变育种,，选育出很多优质、抗病的新品种；,在微生物育种方面：使,利福霉素,发酵水平提高了40%；处理后的,糖化酶,生产菌、,右旋糖酐,产生菌的产量均有较大提高。,离子束的产生装置是,离子注入机,，一般有离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统和靶室组成。,离子源是离子注入机的重要部件，直接决定着离子的种类和束流强度，它的作用是把需要注入的元素电离成离子。许多离子注入机能够单独或同时产生金属和气体离子束。,在,生物诱变育种中经常应用的是,N,+,离子束,。,离子注入和其它常规的辐射诱变及化学诱变过程有明显的差异。离子注入生物体时存在能量传递、动量交换、离子沉积及电荷积累过程，而其它的电离辐射诱变仅仅是能量交换；化学诱变剂考虑的也只是分子基团的交换。因此,离子注入不仅兼有辐射诱变和化学诱变特点和功能,，而且原则上通过精确控制离子种类、注入参数，使离子的能量、动量及电荷等根据需要重新组合，使诱变具有一定的重复性和方向性。但精确的机制尚不清楚。,三、移码突变诱变剂,移码突变是由于,DNA,分子中一对或少数几对核苷酸的增加或缺失，而造成的基因突变。,移码突变的两个特点：,碱基重复（重复碱基处易形成移码突变）；,不能用其它诱变剂回复突变，只有用,吖啶类,才能回复突变,吖啶类染料是有效的,移码突变诱变剂。,常用的有：,吖啶橙,、,二氨基吖啶,（又称,原黄素,）；,噬菌体的有效诱变剂,一系列烷化剂和吖啶类相结合的化合物（称为,ICR,）；,细菌的良好诱变剂,诱变机制：,一般认为和它能嵌入,DNA,分子中间有关。,插入不一定引起移码突变，要形成一个环状分子，不形成环状分子不形成移码突变,移码突变的发生和碱基的重复有关。,吖啶类在单股断口附近单一碱基重复的位点引起,移码组移动的可能机制，,吖啶分子会非常规配对保持足够长的时间，以使复制得以进行。但插入能力与引起的突变不成比例，关键在于能否形成茎环，重复碱基处易形成,移码突变。,转座因子（,transposable element),又称“跳跃基因”,一类能够转移位置的遗传因子。可以在同一染色体上转移位置，也可以在染色体和质粒间转移位置。,广泛分布于原核和真核细胞中。,特点,转座因子可在,DNA,分子的许多位点插入及整合，不需要转座子和目标位点之间广泛的同源性。,转座因子不能自主复制和独立存在于染色体外,（有别于质粒）。没有像病毒那样的生命循环周期而不同于噬菌体。,典型转座是,复制型转座，,即转座子的一个拷贝插入靶,DNA，,而转座子本身却留在染色体原来的位置。,四、生物分子的诱变作用,根据分子结构和遗传性质，转座因子可分为3类：,插入序列（,Insertion sequence,IS）,只含转座基因，不带有使细菌表现任何性状的基因，大小8.5,bp,1.5kb。,当其转移到一个基因中时，便使这一基因成为一个突变基因（称为插入突变）。,转座子（,Transposon,Tn,）,除转座基因外，还有抗药性基因，大小在几个,kb。,当,Tn,插入某一基因时，一方面使这一基因发生突变，另一方面在这一座位上出现了一个抗药性基因。,Mu,噬菌体,几十,kb，,Mu,噬菌体的插入除了使细菌成为某一突变型外，还使它成为一个溶源性细菌。,插入突变可以看作一种染色体畸变。转座因子除了引起插入突变外，还能带来插入位置临近的染色体畸变，包括缺失、倒位、易位等。,切离：转座因子从插入位置消失的过程。,准确切离，回复突变；,非准确切离，同样引起突变效应（染色体畸变）。,基因符号表示：,lac,Z21:Tn3,lac,基因的21位点上插入,Tn3；,gal T,135,:Is4 gal,基因的135位点上插入,Is4,在实验室可以利用已知的转座因子来取得插入突变,（在这里转座因子可以看作是一种诱变剂）,例：利用,Tn,km r,诱,变，筛选,lac,-,的,E.,coli,（,采用,含,km,的,EMB,选择性平板）,Tn,kmr,lac,+,km,s,平板筛选（,EMB+km）,lac,-,km,r,（,插入突变）,转座 （抗,km,的白色菌落）,五、诱变作用的专一性,1.回复突变的专一性,由羟,胺,所诱发的突变不能由羟胺诱发它的回复突变（只引起单向突变）；,吖啶类诱发的突变只能用吖啶类诱发它的回复突变；,缺失突变一律都不能发生回复突变，不论自发或诱发；,转座子的插入突变的回复突变率（切离），任何诱变剂不能提高。,回复突变的诱发，对诱变剂具有高度的专一性。,2.正向突变的专一性,热点（,hot spot）,：,一个基因中突变率特别高的位点。,在,E.,coli,T4,的,r,突变中首先观察到。,（分离到的2400个自发的,r,突变型中，通过基因定位测定，,分属308个位点，在许多位点只发生一次、两次或十几次，,在,r17,位点发生517次。）,热点的存在，说明某一位点上的突变的发生必然和它的临近的和核苷酸顺序有关。与碱基重复顺序有关。,热点是化学诱变剂容易控制到的区域，也为,SOS,修复发生错误的位点。,第四节 自发突变的机制,自发突变的原因：,碱基的互变异构,，稀有式出现，引起错配（转换突变）,（,T，G：,酮式或烯醇式；,C，A：,氨基式或亚氨基式）,环出效应,（模板链弯曲形成凸环）；,自身代谢产物的诱变,（,H,2,O,2,，,重氮丝氨酸等）,转座子,背景辐射和环境诱变,第五节 突变诱发的影响因素,影响突变的因素：,细胞的透性；,DNA,损伤修复和基因突变；,环境；,诱变作用的专一性；,一、诱变剂接触,DNA,分子前,前,突变：,诱变剂所造成,DNA,分子某一位置的结构改变。,1.诱变剂必须进入细胞才能诱发突变。,细胞壁的通透性,将影响细胞对紫外线和化学诱变剂的敏感程度。,如：鼠伤寒沙门氏菌的深度粗糙突变型（,rfa,），,脂多糖不正常，,诱变率比野生型高10倍（诱变剂易进入细胞）,2.细胞质中某些物质可降解或强化诱变剂。,羟化酶,如：陆蒽酮（无诱变作用）海蒽酮（有诱变作用）,肝脏,3.突变的诱发和基因是否处于转录状态有关。,如：,亚硝基胍(,NTG),作用于复制叉位置,lac,-,lac,+,（,回复突变）必须在转录状态才能发生。,4.保护系统：,细菌中至少有2套保护系统：,限制保护系统（甲基化）,保护修复系统（,DNA,损伤修复）,1.光复活作用（,photoreactivation,）,1949年，在放线菌中首先发现光复活作用。经,UV,照射的孢子如果在可见光下培养，存活数高于在黑暗中培养的同一处理样品。,嗜血杆菌虽没有光复活能力，可是经来自具有光复活能力,E.,coli,的,抽提物处理后，具有了光复活能力。,19591960年，发现了光复活酶。,E.,coli,的光复活酶由471个氨基酸组成，分子量为35,kD,，,由,phr,基因编码，位于染色体上16分钟。在暗处不起作用。,二、,DNA,损伤修复,机理：,光复活酶（,photolyase,）,在可见光下被激活，使胸腺嘧啶二聚体,分解成单体。,该修复机制不是移去或取代核苷酸，,而是胸腺嘧啶二聚体直接被修复，,所以是一种,无错误的修复（,error free）,。,低等生物的主要修复机制。,广泛存在于生物界，但生物越高等进化，光复活的作用越弱。,特点：,必须有,可见光（提供能量）；,只涉及的一条链，不需要另一条链的帮助；,特异性强,（只作用于,UV,引起的,DNA,嘧啶二聚体）,。,2.切除修复（,excision repair，,又称暗修复）,在,三种酶的协同作用下进行：,切除酶（一种内切酶，在链的损伤部位,两侧同时切开）,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,这三种酶都不需要可见光激活。,必须依赖未受损的,DNA,互补链。,包括3个步骤：,特异性酶识别,DNA,链中的损伤部位；,DNA,损伤部位被切离；,在,DNA,聚合酶,和,DNA,连接酶的作用下完成修复。,E.,coli,的,UvrABC,核酸内切酶,：由,uvrA,uvrB,，,uvrC,三个基因编码三个亚基。,对损伤的,DNA,进行识别和切割,。切割时从受损,DNA,的,两侧位置上各造成一个切口，切下包括损伤,DNA,在内的一个1213个核苷酸片段。,UvrAB,识别损伤,UvrBC,在,DNA,上切一缺口,UvrD,使被标记区解旋,Uvr,系统在修复各阶段中的作用,是,一种普遍的修复系统。能移去胸腺嘧啶,二聚体和修复大多数引起的,DNA,扭曲损伤。,从低等到高等生物都需要这种修复。,（着色性干皮病,是一种切除修复酶的缺陷）,3.重组修复（,recombination repair）,重组修复,发生于,DNA,复制过程或复制之后，所以又称为,“复制后修复”；,切除修复,和,光修复,均发生在,DNA,复制之前。,光,复活,：使胸腺嘧啶二聚体复原为二个单体；,切除修复,：将胸腺嘧啶二聚体切除；,重组修复,：在不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下进行,的修复作用。,可把这三种修复作用看作生物对外界环境对于遗传物质的损伤所设置的层层屏障。,子链中的缺口由母链填补，而母链中失去的部分由,DNA,聚合酶和连接酶进行修复。,E.,coli,在不切除,TT,二聚体的情况下，以带有二聚体的单链为模板合成互补单链。,子代,DNA,链在损伤的对应部位留下缺口,其互补链则复制成完整的双链,RecA,蛋白结合在有缺口的单链,DNA,上，并与完整双链的同源区进行配对交换,在,重组修复过程中，原母链中的损伤部位并未被切除，损伤部位仍然要依靠再一次的切除修复，或经一定代数的增殖以后损伤的,DNA,链将,逐渐稀释，最后无碍于细胞的正常生长和繁殖。,说明：,E.,coli,对,UV,所造成的损伤修复，依赖于切除和重组修复系统。如果不被修复，少数几个,TT,二聚体的存在就可造成死亡；野生型细菌的,DNA,中即使产生了大量的二聚体而仍然能大量地存活，就是因为它有多种有效的修复系统。,4.,SOS（save our soul）,修复系统,SOS,是,DNA,分子受到较大范围的重大,损伤时诱导的一种修复系统,，而且是唯一,导致基因突变,的修复机制，也叫“差错修复”。,而前面的三种修复发生是不需要诱导的。,差错倾向修复,（,Error prone repair）,1953,年，,Jeam Weigle,等发现,UV,感染,E.,coli,(,用,UV,照射过)存活率高,噬菌体 突变型增加,E.,coli,(,UV,未照射过)存活率低,说明：,轻度的,UV,照射，使,E.,coli,细胞中出现一种对于,噬菌体,DNA,的,UV,损伤的修复功能，可是在修复,过程中却带来了基因突变。,在,正常细胞中，,LexA,阻遏蛋白阻遏,SOS,基因的表达,DNA,损伤后，激活的,RecA,蛋白使,LexA,自我切割，引起,SOS,基因的表达。,SOS基因：,切除修复基因,重组修复基因,umuC,umuD,RecA,蛋白在,SOS,反应中起着关键作用：,一方面，对细胞中积累的单链,DNA,进行感知，,从而引起,LexA,蛋白的自我切割；,另一方面，促进重组修复。,SOS,系统中，与嘧啶二聚体相对位置上，可以是任何碱基，因而引起突变。,umuC,和,umuD,编码的蛋白帮助细胞耐受,DNA,的损伤，使,DNA,聚合酶能越过损伤部位而继续复制，但在这个过程中引起突变。以上两个基因组成一个转录单位，被,RecA,蛋白阻遏。,UmuC,和,UmuD,替代,DNA,聚合酶中的,蛋白，形成较松弛的夹子,4种,修复机制总结,修复类型,光,复活,切除修复重组修复,SOS,修复,能量来源,可见光,细胞本身水解,ATP,产生,修复机理,修复,DNA,模板（切除修复依赖于另一条链修补合成）,形成新模板,不顾模板,修复功能,避免差错修复,倾向差错修复,只有光复活不切断糖-磷酸键，只有,SOS,修复需要诱导，并导致突变。,两类修复功能,避免差错修复功能,倾向差错修复功能,不论哪一种,DNA,损伤的修复功能发生缺陷的突变型，,都对,UV,格外敏感。,根据对,UV,的,诱变作用，可区分为两种类型：,一类比野生型更为敏感,它们是,避免差错的修复功能的丧失,的结果；,另一类较不敏感,它们是,倾向差错的修复功能的丧失,的结果；,DNA,多聚酶的校正作用,除了上述种种修复作用外，细胞还具有对于复制过程中出现的差错的校正功能。,细胞中,三种,DNA,聚合酶（、）：,具有多核苷酸的聚合作用；,都具有,3 5核酸外切酶,作用,能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。,三、环境因素对突变诱发的影响,咖啡碱,：能抑制切除修复系统中的酶，对,UV,的诱变,有强化作用，为,助,诱变剂；,氯霉素,：抑制蛋白质的合成，对,SOS,诱变促成起相反,作用（,SOS,修复系统是倾向差错的，依赖,于蛋白质诱导合成），为,抗诱变剂,助,诱变剂,：本身没有诱变作用，而能,强化,诱变剂的,诱变效应的物质。,抗诱变剂,：本身没有诱变作用，而能,减弱,诱变剂的,诱变效应的物质。,基因突变和,DNA,损伤的修复有关，所以影响修复系统中的酶活性的环境因素都能影响基因突变。,四、从突变到突变型,突变基因的出现，并不意味着突变表型的出现。,表型的改变落后于基因突变的现象,称为,表型延迟（,phenotypic lag）,突变的细胞必须在野生型基因产物消耗完后，才表现为突变型（,必须培养多代，通过正常的分裂而正常的酶已足够稀释或被分解时，才出现表型属于突变型的细胞）。,表型延迟的原因有二：,分离性延迟,细胞中一般含有二个核质体。突变的基因常是隐性的，所以在一个核质体中发生了一个突变的细菌的表型还是野生型。,二次分裂后突变基因才变为纯合状态,生理性延迟,突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型。,营养缺陷型：突变造成某一种酶的缺陷。,（由于细胞质内含有野生型基因的产物）,噬菌体抗性突变型：突变使细菌表面噬菌体受体的改变。,第六节 致癌物质的检测,诱变作用有两方面的实际意义：,诱变育种中，需要高效的诱变剂；,日常生活中，要求避免接触诱变剂（大部分是致癌物）,要求：,灵敏度,代表性,简便易行,一、诱变作用的测定方法,灵敏度,能将,少数突变型选择出来，将多数未突变类型淘汰掉,要求有效的筛选手段或选择性培养基。,以下突变系统作为测定诱变作用的指标（灵敏度高）：,链霉素依赖型 非依赖,药物敏感 抗性,营养缺陷型 非缺陷型,应用菌落或形态突变作为测定的指标，灵敏度低,。,回复突变比正向突变更易选择,，,正向突变难选择，正向突变具有表型延迟现象,链霉素培养实验,培养基,Str,r,(,抗性),Str,s,（,敏感）,Str,d,（,依赖型）,SM,Str,+,-,+,-,Str,-,+,+,-,代表性,对一种生物具有诱变作用的药物，对其它生物是否,同样有诱变作用？,所有生物的遗传物质都是,DNA,或,RNA,所有的,DNA,或,RNA,都有相同的碱基,突变的诱发,归根到底是诱变剂造成,DNA,分子结构的改变,由此可见,，,诱变剂对于各种生物的作用是基本上一致的,。,但同一种诱变剂对各种生物诱变效应的强弱肯定有所不同,对某一基因有较强诱变作用的药物，对其它的基因,是否也有同样的作用？,回复突变作为测定指标代表性差，但可以采用,一组,已知性状的突变型作为测定指标,。,（因为诱变剂有特定作用，回复突变是,DNA,分子的某一特定结构的改变，一种诱变剂能诱发某一种结构改变，不一定能诱发另一种结构改变）,用正向突变作为测定指标更具有代表性，因其是随机的，但选择困难，灵敏度低，也不易选择。,正向突变可分为诱发某一特定基因和诱发许多基因发生突变两种情况。,同一表型的形态改变可能是许多不同的基因发生突变的结果。,如：枯草芽孢杆菌：40多个基因中的任何一个发生突变，,都不产生正常的芽孢。,同一表型的改变也可能是个别基因发生突变的结果。,如：链霉素抗药性，缬氨酸抗性突变,二测定诱变作用的目的,是否有诱变作用，是否能作为诱变剂使用；,是否能使有生产价值的生物引起提高产量的突变；,对一种生物有诱变作用的药物对其它生物是否也有诱变作用；,对某一基因有较强诱变作用的药物，对其它的基因是否也有同样的作用？,化学致癌物质的检出方法,Ames,试验,美国加利福尼亚大学的,Bruce Ames,教授于1966年发明，,因此称为,Ames,试验,理论依据：,癌变是某些基因发生突变的结果。,实验特点,1）灵敏度高,检测,鼠伤寒沙门氏菌(,Salmonella,typhmurium,),组氨酸缺陷型(,his,-,),的回复突变,菌株特点：,均为,组氨酸缺陷型,，但具有不同的突变类型；,每一缺陷型菌株中又,引入另外两个突变,：,rfa,:,深度粗糙突变型,（细胞表面透性增进，使诱变效果提高约10倍）,uvrB,：,丧失切除修复能力的缺陷型,（使诱变效果提高几十倍）,TA1535(,rfa,uvrB,hisG46),hisG46,是碱基置换；,TA1536(,rfa,uvrB,hisC207)hisC207,移码突变，,GC,对,缺失,TA1537(,rfa,uvrB,hisC3076)hisC3076,移码突变，,GC,对增加,TA1538(,rfa,uvrB,hisD3052)hisD3052,移码突变，,GC,CG,对双缺,2）代表性强,对,微生物有诱变作用的药物，对人类也有诱变作用，只可能是强弱不同；,3）使用等基因菌株,除研究中观察的基因不同外，其它基因完全相同的菌株，代表不同类型的突变型。,4）方法简便,Ames,试验,理论依据：,癌变是某些基因发生突变的结果,。,如果确实这样的话，每一种诱变剂应该都是致癌剂，,但有些诱变剂（如2-氨基嘌呤）却不是诱变剂。,另,一,观点认为，,基因突变和癌变有共同原因，是,SOS,反应。,有一部分突变的诱发并不通过,SOS,反应（如2-氨基嘌呤诱发的突变），这些药物不一定是致癌剂。,噬菌体的诱导释放是一种,SOS,反应,（,RecA,蛋白能降解,c,基因编码的阻遏蛋白，维持溶源性的,），,而且是一种结果明显又便于快速检测的反应，,是比,Ames,试验更为理想的,致癌物质检测系统,。,第七节 诱变育种与突变型的筛选,一、诱变育种,1.目的,提高生产菌种的产量；,使发酵产物单一化；,扩大品种；,扩大菌种的适应范围；,简化工艺；,2.被处理的菌体要求,细胞分散，均匀；,最好单核，核质体越少越好；,对霉菌和放线菌，菌丝为多核，应用孢子；,芽孢杆菌应用芽孢；,采用对数期的细胞；霉菌和放线菌的孢子,稍稍萌发；,3.诱变剂的选择和剂量,如：选,营养缺陷型,：,单基因控制，,质量性状,（非此即彼，如抗性与敏感）,用强,诱变剂，如,NTG,目的,诱变剂：,亚硝基胍(,NTG),：,超,诱变剂，不能接触皮肤；,甲基磺酸乙酯