真菌常用的体外药敏试验方法比较.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌药敏试验临床难以开展的原因,1.按照,NCCLS,推荐的稀释法,操作繁琐,2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到,NCCLS,认可,4.,E,试验价钱太贵,5.药敏孵育时间因菌种而不同,体外敏感试验与临床治疗相关性,真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好,对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实,体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用,真菌体外药物敏感试验方法,NCCLSM27-A：,常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法,E-test,法,NCCLS M44-P,纸片扩散法(仅限氟康唑),丹麦,Rosco,纸片扩散法(,NCCLS,未认可),真菌体外药敏用培养基,常量肉汤和微量肉汤法,RPMI1640,液制备：,RPMI 10.4g,MOPS（,三氮吗啡啉丙磺酸）,34.53 g,蒸馏水,900ml,溶解后，用,1M,NaOH,调节,PH,至,7.0,（,25,），用蒸馏水溶至,1000ml,，,高压灭菌后，冷却至50,加入,RPMI1640,用,0.22m,滤膜抽滤除菌，,4,保存,。,真菌体外药敏用培养基,E-test,法,：,在,RPMI,液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为,2%,。,NCCLS,纸片扩散法,：,Mueller-Hinton,琼脂,补充,2%,葡萄糖和,0.5g/ml,美蓝,丹麦,ROSCO,纸片扩散法,：,改良的,SHADOMY,（,PH7.0,）培养基,主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。,菌液制备,将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用,0.85%,的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到,0.5,麦氏比浊标准（约为,1510,6,CFU/ml,）。,常量稀释法：,用,RPMI1640,液体稀释,2000,倍,接种浓度约为,0.52.510,3,CFU/ml,微量稀释法,：用,RPMI1640,液体稀释,1000,倍,接种浓度约为,1,510,3,CFU/ml,E-test,法和,NCCLS,纸片扩散法,：用菌液浊度为,0.5,麦氏单位。,Rosco,纸片扩散法,：,1.念珠菌：,0.5,麦氏浊度，生理盐水,1,：,10,稀(,1510,5,CFU/ml),2.隐球菌属：,1.0,麦氏浊度,3.其它酵母菌：,0.5,麦氏浊度，生理盐水,1,：,1,稀释,常量肉汤法(,M27-A),先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的,RPMI1640,液倍比稀释，使其起始浓度为640,g/ml,终末浓度为1.,25g/ml,，分装无菌洁净的,12mm75mm,试管：,64,32,16,8,4,2,1,0.5,.25,.125,前10管：0.2,ml,氟康唑1.8,ml,菌液,念珠菌属,35,孵育,48,小时,新型隐球菌,72,小时,读取,MIC,结果,2ml,菌液,1.8,ml1640,常量稀释法,药敏结果判定,氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制,其他唑类药物为,80%,抑制,（取,0.2ml,的生长对照菌液加入,0.8mlRPMI,液体培养基的菌液浓度）,质控株 克柔念珠菌,ATCC 6258,近平滑念珠菌,ATCC 22019,白念珠菌,ATCC 90028,白念珠菌,ATCC 24433,微量肉汤法,氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为,2,常量法的浓度（即,128g/ml,），终浓度为,0.25g/ml,。,。,37,。,37,64,32,16,8,4,2,1,.5,.25,.125,氟康唑：1-10孔分别为 100,ul,菌悬液：1-10孔分别为 100,ul,200,ulRPMI,汤,200,ul,菌悬液,35,新型隐球菌,72,小时，,其余菌株,48,小时读取,MIC,结果,酵母菌的,NCCLS M27-A,各药物折点,粘膜及系统性感染：,氟康唑（除克柔念珠菌）敏感：,8g/ml,中介：,耐药：,64g/ml,粘膜感染：,伊曲康唑 敏感：,0.125g/ml,中介：,耐药：,1g/ml,粘膜及系统性感染：,5-,氟嘧啶 敏感：,4g/ml,中介：,816g/ml,耐药：,32g/ml,酵母菌,E-test,法,瑞典,AB,Biodisk,优点：有较好的重复性和稳定性,MIC,E-test,法,0.5,麦氏比浊液（约为,1510,6,CFU/ml,）。,菌悬液均匀涂布于药敏板上,35,培养,24,小时读取结果,光滑念珠菌,新型隐球菌,等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。,E-test,法评价,准确性高,且操作简便,E-test,法得到的,MIC,值在某些菌种中要低于,NCCLS,推荐的常量肉汤稀释法测得的,MIC,20%,浓度,CO2,的环境中，可使此方法的结果更真实反映药物对致病菌的敏感性,缺点：1.价格太高 每片40-50元,2.,吡咯类,MIC终点不好确定,酵母菌纸片扩散法敏感试验,NCCLS M44-P.2003,培养基：,Mueller-Hinton,琼脂,补充 2,Glucose,0.5ug/ml,Methylene,blue dye,PH7.2-7.4,优点：有较好的重复性和稳定性,操作简便，价廉,缺点：目前只限氟康唑,NCCLS,纸片扩散法,0.5,麦氏比浊标准（约为,1510,6,CFU/ml,）。,菌悬液均匀涂布于药敏板上,步骤同细菌敏感试验操作一致，,35,37,孵育,18,24,小时，,对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至,1,麦氏单位，孵育,48,小时，,光滑念珠菌也需孵育,48,小时读取抑菌环直径。,酵母菌纸片扩散法敏感试验,NCCLS,M44-P.2003,氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度,抑菌环直径,（,mm),MIC,（,ug,/ml),敏感（,S),=19,=8,剂量依赖性敏感,（,SDD),15-18,16-32,耐药（,R),=64,S,Susceptible SDD=Susceptible,Dose Dependent R=Resistant,酵母菌纸片扩散法敏感试验,NCCLS M44-P.2003,氟康唑对标准菌株 24,h,抑菌环直径（,mm),的质控允许范围,标准菌株氟康唑25,ug,沃尔康唑1,ug,白念珠菌,ATCC90028,28-39,31-42,近平滑念珠菌,ATCC2201922-33 28-37,热带念珠菌,ATCC75026-37 ,克柔念珠菌,ATCC6258 16-25,ROSCO,纸片扩散法,ROSCO,纸片扩散法,：,1.克柔念珠菌：,0.5,麦氏浊度，生理盐水,1,：,10,稀释,菌液为,510,5,CFU/ml,2.隐球菌属：,1,麦氏浊度,3.其它酵母菌：,0.5,麦氏浊度，生理盐水,1,：,1,稀释,菌液为2.5,10,6,CFU/ml,将稀释好的菌液涂布在改良的,SHADOMY,（,PH7.0,）培养基上,其它操作同细菌。,读取抑菌环直径近似到,mm,在大约,80%,抑制区为测量边界,在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落，15,可忽略不计,Rosco,纸片扩散法,药敏结果判定,两种纸片扩散法的比较,Rosco,纸片扩散法,检测菌种 念珠菌属，隐球菌属,培养基 改良,SHADOMY,琼脂，,PH7.0,试验药品及剂量,AMB 10g,，,IT 8g,，,FLA 15g,，,FC 1，10g，FC 10g，KET15g,等,接种的菌量：,510,5,CFU/ml,（克柔念珠菌先制成,0.5,麦氏浊度，再用生理盐水,1,：,10。,隐球菌属配,1.0,麦氏不稀释）其它菌种配,0.5,麦氏浊度，,1,：,1,稀释,培养条件 念珠菌属,35,培养,1824,小时，,新型隐球菌,30,培养,4248,小时,结果判读,FC及,AMB100%,被抑制,唑类药物,80%,抑制,质控株 光滑念珠菌,2238NL,白念珠菌,ATCC64548,白念珠菌,ATCC64550,NCCLS,纸片扩散法,检测菌种 念珠菌属，隐球菌属,培养基,Mueller-Hinton,琼脂中补充,2%,的 葡萄糖和,0.5g/ml,的美蓝,试验药品及剂量,FLA,25g,接种的菌量,1,510,6,/mL,隐球菌 1.0麦氏浊度,培养条件,35,孵育,18,24,小时,新型隐球菌培养,4248,小时,结果判读,FC,及,AMB100%,被抑制，,唑类药物,80%,抑制,质控株 白念珠菌,ATCC90028,近平滑念珠菌,ATCC22019Rosco,纸片扩散法各药物折点,粘膜酵母菌感染,氟康唑，克霉唑，酮康唑，,氟胞嘧啶1,ug,，,特比奈吩，咪康唑等,敏感：,20mm,中介：,1219mm,耐药：,11mm,两性霉素,B，,制霉菌素,伊曲康唑 敏感：,15mm,中介：,1014mm,耐药：无抑菌环,氟胞嘧啶10,ug,敏感：,30mm,用于黑曲霉,中介：,2329mm,耐药：,22mm,灰黄霉素 敏感：,10mm,中介：,耐药：无抑菌环,系统性酵母菌感染,氟康唑15,ug,18-24h,敏感：,30mm 4,中介：29,23mm 8-16,耐药：,22mm 32,伊曲康唑 8,ug,18-24h,敏感：,20mm 0.06中介：19,12mm 0.125,耐药：,11mm 0.25,这个,MIC,标准为纸片法的相应值,Rosco,纸片扩散法各药物折点,系统性酵母菌感染,酮康唑 15,ug,纸片和培养基广州乐通公司可供应,敏感：,30mm 0.12,中介：23-29 0.25,耐药：,22,mm 0.5,两性霉素,10ug,敏感：,15mm 1,中介：14-10 2,耐药：,9,mm 4,氟胞嘧啶1,ug,敏感：,20mm 4,中介：12-19 8-16,耐药：,11,mm 32,氟胞嘧啶10,ug,用于黑曲霉,敏感：,30mm 4,中介：23-29 8-16,耐药：,22,mm 32,Rosco,纸片扩散法各药物折点,两性霉素,B,克霉唑-,特比奈酚,结论,1.,常量,稀释法,难以推广,2.,微量,板浪费,3.NCCLS,纸片法只做,氟康唑,4.建议目前用,Rosco,纸片,5.寄希望将来推行,Etest,法,