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5、xt styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,生工本,2009,级,4,班,刘培培,20092513418,L-,天冬酰胺酶的生产工艺,LOGO,(一)天冬酰胺酶的化学组成和性质,天冬酰胺酶是酰胺基水解酶,是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物,用于治疗白血病。,1922,年,Clementi,发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶;,1953,年,Kidd,发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质,其活性成分是蛋白质;,1961,年,Broome,确定了其有效成分是天冬酰胺
6、酶,后来,,Mashburn,等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶,具有同样抗癌活性。,天冬酰胺酶呈白色粉末状,微有湿性,溶于水,不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇,水溶液,20,储存,7d,,,5,储存,14d,均不减少酶的活力。干品,50 15min,酶活力降低,30,,,60 1h,内失活,最适,PH8.5,,最适温度,37,。,(二)国内天冬酰胺酶的发展历程,目前,国内临床上应用的,L,2ASP,主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于,1974,年开始生产,E,1,coli,天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,
7、1995,年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了,E,1,coli,天冬酰胺酶,ansB,基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达,L,2ASP,的基因工程菌,pKA/CPU210009,工程菌发酵单位比野生株高出,100,倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组,L,2ASP,的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性,。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用,E,1,coliL,2ASP,开辟了新的道路,。,(三)抗肿瘤机制,L,2ASP,抗
8、肿瘤的作用机制在于它能够降低人 体内,L,2,天冬酰胺和,L,2,谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成,L,2,天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源,L,2,天冬酰胺才能存活。当外源,L,2,天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此,L,2ASP,能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明,L,2ASP,能够选择性抑制体内,Ra2pamycin2,靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值,。另有文献报道,L,2ASP,在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的,p53,蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡,。,(四)工艺流程,大肠杆菌产生
9、的,L,2ASP,包括,L,2ASP,和,L,2ASP,其中,L,2ASP,存在于细胞质中,与底物,L,2,天冬酰胺的亲和力很小,(Km=1 10-3 mol/L),没有抗肿瘤活性,;,而,L,2ASP,则分泌在细胞周质中,与,L,2,天冬酰胺有很高的亲和力,(Km=1 10-5 mol/L),有抗癌活性,3,。现今,产生,L,2ASP,的菌种主要包括,Escherichia coli,、,Erwinia carotovara,、,Serralia marcescem,、,PseudomonasSp,1,、,Wolinella succinogenes,等。主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀
10、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等,8,16,。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为,220,520157 U/mg,总回收率为,31%,86%,。,天冬酰胺酶工,艺流程图,大肠杆菌,肉汤菌种,种子,菌种,发酵液,菌体,提,取液,上清液,沉淀,洗脱液,洗脱液,冻干,L-,天冬酰胺酶,菌种培养,肉汤培养基,37 48h,玉米浆培养基,37 4-8h,种子培养,发酵,玉米浆培养基,37 6-8h,离心,提取,蔗糖抽提液,PH7.5 30,分级沉淀,(,NH,4,),2,SO,4,55,饱和度,PH7.0,分级沉淀,(
11、NH,4,),2,SO,4,90,饱和度,离子沉淀,DEAE-,纤维素,(DE52),离子交换,CM-,纤维素,(CM52),工艺过程及要点,1,菌种培养,采用大肠杆菌,Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁,100mL,蛋白胨,1g,氯化钠,0.5g,琼脂,2-2.5g 37,在试管中培养,24h,,茄形瓶培养,8h,,锥形瓶培养,16h,。,2,种子培养,培养基用玉米浆,30kg,,加水至,300kg,,接种量,1%-1,。,5%,,,37,,通气搅拌培养,4-8h.,一、总述,3,发酵罐培养,取玉米浆,100Kg,,接种量,8%,,,37,,通气搅拌培养,
12、6-8h,,离心分离发酵液,得菌体加,2,倍量丙酮搅拌,压滤,滤饼过筛,自然风干成菌体干粉。,4,蔗糖溶液抽提,将菌体细胞中加入,5,倍体积的蔗糖溶液(蔗糖,40%,溶菌酶,200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30,振荡,2h,8000r/min,离心,收取上层酶液。,5,硫酸铵分级沉淀,取上述酶液,加入,(,NH,4,),2,SO,4,至,55%,饱和度,调,PH,至,7.0,,室温搅拌,1h,,离心除去沉淀,取上清液加入(,NH,4,),2,SO,4,到,90%,饱和度,离心收集沉淀。,6,纯化,将沉淀用,50mmol/L,PH7.0,磷酸缓冲液溶解并透析,透析后的酶液
13、通过预先用,10mmol/L,,,PH7.6,磷酸缓冲液平衡的,DEAE-,纤维素层析柱(,1cm30cm,),用,30mmol/L,磷酸缓冲液洗脱,流速为,40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分,再调整,PH4.8,通过预先用,50mmol/L,PH4.9,的磷酸缓冲液平衡的,CM-,纤维素层析柱(,1cm8cm,),用,50mmol/L,PH5.2,的磷酸缓冲液洗脱,收集酶活性组分,冷冻干燥,即得,L-,天冬酰胺酶冻干粉,总收率为,31%,,比活为,220U/mg,蛋白。,二、工艺流程图,(,1,),丝状菌三级,发酵,工艺流程冷冻管(,25,C,,孢子培养,,7,天),斜面母瓶(,25,C
14、孢子培养,,7,天),大米孢子(,26,C,,种子培养,56h,),一级种子培养液(,27,C,,种子培养,,24h,),二级种子培养液(,2726,C,发酵,7,天),发酵,液。(,2,),球状菌二级,发酵,工艺流程冷冻管(,25,C,,孢子培养,,68,天),亲米(,25,C,,孢子培养,,810,天),生产米(,28,C,,孢子培养,,5660h,),种子培养液(,2625-24,C,,发酵,,7,天),发酵,液。,三、青霉素发酵过程,青霉素发酵时,青霉素生产菌在,合适的培养基、,PH,、温度和通气搅拌,等发酵条件下进行生长并合成青霉素。,发酵开始前,有关设备和培养基(主要是碳源、氮
15、源、前体和无机盐等)必须先经过,灭菌,,后接入种子。,在整个过程中,需要不断,通气和搅拌,,维持一定的罐温和罐压,在发酵过程中往往要加入,泡沫剂,,假如酸碱控制发酵液的,PH,,还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充,碳源及氮源,,或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。,青霉素发酵过程中的代谢变化分为,菌体生长、青霉素合成和菌体自溶,三个阶段。,菌体生长阶段,:发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应,即开始发育、生长和繁殖,直至达到菌体的临界浓度。,青霉素合成阶段,:这个阶段主要合成青霉素,青霉素的生产速率达到最大,并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段,菌体重量有所增加,但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。,菌体自溶阶段,:这个阶段菌体衰老,细胞开始自溶,合成青霉素能力衰退,青霉素生产速率下降,氨基氮增加,,PH,上升。,






