脓汁和粪便标本中病原菌的检测-5.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,器材准备,斜面培养物,4,支，营养肉汤培养物（菌液）,4,支，半固体琼脂,4,支，,营养琼脂平板,4,个，微量发酵管,1,套，青链庆纸片,1,套，眼科镊子,2,把。,医学微生物学实验,综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五）,糖发酵试验,药敏试验,血浆凝固酶试验,半固体接种法,糖发酵试验,Sugar Fermentation Test,不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此,，可以鉴别各种细菌。,糖发酵管,:,葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等。指示剂：溴甲酚紫，,PH,6.8,为紫色，,5.2,为黄色。,原理：多糖单糖丙酮酸、酸性产物,(,产气,)pH,指示剂呈酸性变色。,结果,:,培养基变色,无,气泡,“,+,”,，培养基变色,有,气泡,“,”,，培养基,不,变色,“,-,”,。,应用,:,观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。,甲紫黑葡萄糖,乙紫黑,乳糖,丙粉红葡萄糖,丁粉红,乳糖,2-3cm,37 24,小时,细菌的糖发酵试验,实验分组,俩俩相对,4,人为,一个小组,组号编在电源插座上。,每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙,4,丙 丁,甲 乙,3,丙 丁,甲 乙,2,丙 丁,甲 乙,1,丙 丁,甲 乙,5,丙 丁,甲 乙,8,丙 丁,甲 乙,7,丙 丁,甲 乙,6,丙 丁,甲 乙,10,丙 丁,甲 乙,9,丙 丁,讲,台,抗菌素敏感性试验,Antibiotic Susceptibility Test,磺胺,1907,年发现，,1935,年临床应用。青霉素,1929,年发现，,1945,年临床应用。,我国住院病人抗菌素使用率达,70%,，新生儿病房抗菌素使用率达,100%,。,为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时），做药物敏感性试验。,滤纸片扩散法,Disc Agar Diffusion Method,将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈,依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。,敏感（,Sensitive,）：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。,耐药（,Resistant,）：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治愈。,试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,抗菌素敏感性试验,分工,甲黄色菌液平板,+,青、链、庆纸片。,乙白色菌液平板,+,青、链、庆纸片。,丙紫黑菌液平板,+,青、链、庆纸片。,丁粉红菌液平板,+,青、链、庆纸片。,每人,1,个营养琼脂平板,抗菌素敏感性试验,方法,接种环取菌液,3,5ul,2,环,在平板培养基表面，拉出,2,条细菌接种线，使呈,“,十字形,”,(,注意：,操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）,平板密集划线接种细菌（纱窗样）。,设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约,15mm,。,作标记：青、链、庆。,镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。,3718,24,小时培养，观察结果。,试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,灭菌 取菌液,2,次,甲黄色菌液,乙白色菌液丙紫黑菌液,丁粉红菌液,3,5ul,+3,5ul,接种线呈十字形,纸片扩散法：,菌液,密集涂布平板 标记,:,青、链、庆 贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片 按压 倒置培养,18,24,小时 观察结果。,青,链,庆,青,链,庆,标记,贴抗菌素纸片,凝固酶试验,Coagulase,Test,致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。,葡萄球菌产生两种凝固酶,:,一种是与细胞壁结合的凝固酶,为结合凝固酶,;,另一种是细胞释放于培养基中,为游离凝固酶；二者抗原性不同。,在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁殖、引起感染。,体外试验有试管法和玻片法两种。,试管法检测游离凝固酶，结果准确。,玻片法只能检测结合凝固酶，比较简便，常作为快速筛选技术（金黄色葡萄球菌中有,10%,15%,可呈阴性反应）。,凝固酶试验试管法,：,游离凝固酶凝血酶,纤维蛋白原纤维蛋白,血浆凝固,凝固酶试验玻片法：,结合凝固酶（菌体表面）,纤维蛋白原纤维蛋白,细菌凝集,凝固酶试验,玻片法,取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。,分别用接种环取白色和黄色菌苔,(2,3,个菌落的菌量,),与血浆研磨混合，立即观察结果。,菌液出现明显凝块为阳性，否则为阴性。,白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。,反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。,载玻片,1,张,兔血浆各,15ul,右侧血浆与白色菌苔混合,左侧血浆与黄色菌苔混合,半固体穿刺接种法,Stab Semisolid Method,具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移,动扩散生长，使培养基呈扩散云雾状混浊状态。,无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长,繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。,方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部,4/5,处，再循原来的路线，退出接种针。,甲紫黑，乙紫黑；丙粉红，丁粉红,。,半固体穿刺接种法,甲紫黑,乙紫黑,丙粉红,丁粉红。,37,24,小时标记,:,组号,颜色,生物安全警告,本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）,操作,，,可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。,气溶胶粒径,100um,沉降很快,50um,在,0.4s,内扩散开,5um,通过呼吸道直接到达肺泡。,Pike,博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达,82%,，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。,实验时应坐着，,在火焰周围,10,20,厘米内操作，,保持安静、有序，尽量少说话、少走动，,以免感染病原菌,。,细菌的糖发酵试验,P,16,甲紫黑葡萄糖 乙 紫黑乳糖,丙粉红葡萄糖 丁 粉红乳糖,细菌的药敏试验,P,20,（菌液）,甲黄色平板,青、链、庆纸片,乙白色平板,+,青、链、庆纸片,丙紫黑平板,+,青、链、庆纸片,丁粉红平板,+,青、链、庆纸片,血浆凝固酶试验,P,17,兔血浆,15ul+,黄色,白色,半固体接种法,P,11,甲紫黑，乙紫黑，丙粉红，丁粉红。,思考题,细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义,?,为什么要在发酵管液面上方大约,2,3cm,处切割？,培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？,抗生素敏感性实验有何实际意义,?,血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么,?,半固体穿刺接种时，为什么要强调,“,原路返回,”,?,为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照,?,微量发酵管管口朝下，,37,培养,18,24,小时。,塑料筐一侧垫高,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。,试管架上器材：靠近插座一侧第,1,和第,2,列分别放置接种针,和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,