AmpC酶的研究进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,AmpC,酶的研究进展,叶 英,细菌AmpC酶的研究进展,安徽医科大学第一附,属医,院,感染病科安徽省细菌耐药监控中心,叶英,1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,The prevalence of Infectious Diseases,开发一种新抗生素需要,10,年,需花费,5-10,亿美元,一代耐药菌的产生只要,2,年时间,后抗生素时代已经来临？！,携带,NDM1,的超级大肠埃希菌,细菌耐药的主要机制,灭活酶产生,孔蛋白改变,主动外排,其他机制,靶点改变,灭活酶种类,-,内酰胺酶,氨基糖苷类钝化酶,:,磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶,氯霉素乙酰转移酶,其它：磷霉素、红霉素乙酰化酶,林可霉素、克林霉素乙酰化酶等,-,内酰胺酶：最主要的灭活酶,目前已发现,300,多种,新的种类不断出现,对,-,内酰胺抗生素造成严重威胁,临床关注的重要,-,内酰胺酶,超广谱,-,内酰胺酶,(,ESBLs,),高产头孢菌素酶,(,AmpC,酶,),碳青霉烯类酶,(,Ambler B,类,金属酶,;,Ambler A,D,类,-,内酰胺酶,),1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,AmpC,酶的定义,是由,革兰阴性细菌,(,肠杆菌科细菌,铜绿,假单胞菌等,),的染色体或质粒介导产生的一类,内酰胺酶，属,Bush,分类（底物谱分类法）,Group 1,，,Ambler,分类（分子结构分类法）,Class C,首选作用底物是头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制,因此在国内又称作头孢菌素酶。,因可被某些,内酰胺类抗生素诱导产生,又称诱导酶。,AmpC,酶生化特性,相对分子量,(,Mr,),介于,38-42,KDa,。,灭活,-,内酰胺酶抑制剂，如对克拉维酸等不敏感,.,正在研究开发的硼酸类抑制剂,BRL42715,、,RO48-1265,、,RO48-1220,对其有较强的抑制作用。,AmpC,酶生化特性,对青霉素类抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青霉素（替莫西林）外均耐药。,对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药。,对头霉素类耐药。,对第四代头孢菌素一般表现为敏感。,对碳青霉烯类抗生素敏感。但细菌高产,AmpC,酶结合外膜孔蛋白缺失可导致对其耐药。,产,ESBL,与,AmpC,的耐药谱差别,ESBL,AmpC,耐药谱多重 多重,对三代头孢多耐药 耐药,头孢吡肟多敏感 敏感,哌酮,/,舒巴坦大多敏感 耐药,哌拉,/,他唑巴坦大多敏感 耐药,头霉素大多敏感 耐药,碳青霉烯类敏感 敏感,产,AmpC,酶细菌感染的患者死亡率显著升高,32%,15%,P=0.03,死亡率,%,非耐药菌,产,AmpC,酶耐药菌,产,AmpC,酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的,2,倍,1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,AmpC,酶的基因构成,由,5,个不连锁基因即,ampC,、,ampR,、,ampD,、,ampE,和,ampG,组成,ampC,是,AmpC,酶的结构基因，编码产生,AmpC,酶蛋白,基因,ampR,、,ampD,、,ampE,、,ampG,是,AmpC,酶的调节基因，参与调控,AmpC,酶的合成过程。,AmpC,酶的基因构成,ampR,是,AmpC,的转录调节因子，属于,LysR,调节子家族。,AmpR,在非诱导状态下作为,ampC,转录的抑制因子，而在诱导状态下作为转录激活因子存在。,ampD,是,AmpC,表达的负调控基因，位于远处染色体上，参与肽聚糖代谢。,ampD,的基因序列与,AmpC,酶的表现型密切相关。,AmpC,酶的基因构成,AmpE,蛋白充当一个感受器，协助,ampD,完成对,ampC,的阻遏作用，在整个调节系统中居次要地位。,ampG,编码转膜蛋白,AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚糖量的变化，在,AmpC,酶的表达中起着向胞浆内传递诱导信号的作用。,染色体,AmpC,酶表达类型,（,1,）诱导高产型,:,低基础水平和高诱导产生,（,2,）持续高产型,:,高基础水平持续表达，,亦称：稳定的去阻遏表达型,（,3,）持续低产型,:,低基础水平持续表达,（,1,）诱导高产型,当有诱导作用的,内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC,酶的产量明显增加,增加的范围在,100,1000,倍之间。,（,2,）持续高产型,原因为去阻遏突变,即调控基因之一的,ampD,基因发生突变,产生有缺陷的,AmpD,蛋白,不能与,AmpR,调控蛋白结合形成复合物,AmpR,蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起,AmpC,酶的大量表达。,（,3),持续低产型,部分产,AmpC,酶的菌株持续低水平的产生,AmpC,酶,其原因可能是缺乏,ampR,基因或,ampR,基因发生突变,产生有缺陷的,AmpR,蛋白,不能在无,内酰胺类存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有,内酰胺类存在的条件下起到激活子的作用,故,AmpC,酶得以持续低水平表达。,1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,AmpC,的发展简史,20世纪,90,年代前，为染色体型。,90,年代后发现质粒型，呈持续高表达,并在同种和,不同种细菌间水平播散，造成更严重的耐药性。,质粒型,AmpC,种类在不断增加，目前已达,50,余种。,产质粒型,AmpC,酶细菌：没有或具有不健全,AmpC,染色体的细菌种属具有健全,AmpC,染色体的细菌。,质粒,AmpC,酶流行背景,1989,年,Bauenfeind,等报道了质粒,AmpC,酶,CMY-1,，,但没有提供其生化特征。,第一个公认的质粒,AmpC,酶是,1988,年在美国普罗维登斯一家医院由,Papanicolaou,等从肺炎克雷伯菌中发现的,MIR-1,。,从此以每年发现,1,3,个新质粒的速度增加。,质粒,AmpC,酶的世界流行状况,非洲,ACC-1，CMY-4,亚洲,MOX-1,，,DHA-1,，,ACT-1,FOX-2,，,CMY-I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26,欧洲,BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2，FOX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1,美洲,MIR-1,，,ACT-I,，,FOX-1/2/5/6/8/10,，,CMY-2/3/4/5/19/20/23/24/25,我国,pAmpC,酶的检测状况,北京协和医院,ACT-1,，,CMY-2,首都医科大学,DHA-1,，,CMY-2,中山医科大学,DHA-1,ACT-1,CMY-2,浙江医科大学,DHA-1,，,CMY-2/4/11,上海市传染病医院,安徽医科大学,DHA-I,，,CMY-2,DHA-1,，,ACT-1/2,，,CMY-2,，,MOX-4,，,ACT-6,pAmpC,酶的来源,系统进化树研究表明：,pAmpC,酶和某些菌属的染色体,AmpC,酶有着高度的同源关系。,根据和不同菌属的染色体,AmpC,酶的同源关系，,pAmpC,酶可分为以下,5,组：,pAmpC,酶的分类,弗氏,枸橼酸杆菌组,LAT-1/2/3/4,、,CMY-2/3/4/5/6/7/9,、,BIL-1,阴沟肠杆菌群组,MIR-1、ACT-1,气单胞菌属组,MOX-1/2,、,FOX-1/2/3/4/5/6,、,CMY-1/8/11,摩根摩根菌组,DHA-1/2,蜂房哈夫尼菌组,ACC-1,pAmpC,酶的来源途径推测,推测质粒介导的,AmpC,酶基因是来源于染色体的，目前大量的线索表明可能是通过整合子实现的。,整合子,(,Integron,),是近来新发现的能将耐药基因传递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因，是细菌遗传进化天然克隆和表达系统。,1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,AmpC,酶的检测方法,表型检测,基因检测,pAmpC,酶确认需分两步,:,(1),明确是否为高产,AmpC,酶,(2),是否为质粒介导,:,通过质粒接合实,验、,Southern,杂交证实,AmpC,酶的检测方法,表型检测方法,:,头孢西丁敏感实验,头孢西丁三维试验,头孢西丁敏感试验,操作：按,CLSI,标准操作,判断：,K-B,法,16g/ml,为,耐药,意义：耐,FOX,的菌株有可能产生,AmpC,酶,缺点：特异性差,头孢西丁三维试验,将,0.5,麦氏单位大肠埃希菌,ATCC25922,菌液涂布于,M-H,平板上，取,30g,头孢西丁纸片置于平皿中心，用刀片在离纸片边缘,5mm,处放射状地由里向外切割一道狭缝，取,40,微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将,MH,平板放入,35,孵箱过夜。,头孢西丁三维试验,结果判断：,出现,ATCC25922,箭头样生长，,为三维试验阳性。,是目前公认的检测,高产,AmpC,酶的经典方法。,AmpC,酶的检测方法,基因检测法,:,1,聚合酶链反应,(PCR),2,核酸杂交,(Southern blot),3,核苷酸序列分析法,:,是诊断最可靠和发,现新酶的方法,AmpC,酶的检测方法,方法虽多，但至目前,CLSI,仍未制定临床筛选,AmpC,酶的标准，随着产,AmpC,酶的革兰阴性杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视，需要建立一种快速、简便的方法常规筛选,AmpC,酶，任务任重而道远。,1,研究,AmpC,酶的科学意义,2,AmpC,酶的生化特性,3,AmpC,酶的基因与表达,4,AmpC,酶的发展简史,5,AmpC,酶的检测,6,产,AmpC,酶菌的治疗与预防,药物治疗,给予抗菌治疗后因为敏感菌株的相继死亡，突变菌株被选择出来,耐药的克隆在过去曾是敏感的菌落中生长,在治疗过程中耐药成为临床表现,敏感菌落中存在着自发的突变菌株,耐药是选择出来的,不宜使用第三代头孢,三代头孢菌素是,AmpC,酶的弱诱导剂，但诱导产生的低水平的,AmpC,酶不足以导致对三代头孢菌素的耐药，而在,AmpC,基因阳性菌株中使用三代头孢菌素，可能会筛选出高产,AmpC,酶的耐药株，导致耐药菌流行。因此,:,合理使用三代头孢菌素是减少,高产,AmpC,酶突变株引发耐药的关键。,不应用,-,内酰胺酶复合制剂,克拉维酸不抑制,AmpC,酶，反而为强诱导剂,;,舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果也非常有限；,故,-,内酰胺酶抑制剂的复合制剂不应用于,治疗高产,AmpC,酶耐药株感染。,第四代头孢菌素,对,AmpC,酶亲和力较低（较高的,Km,值）,能快速地通过细菌的外膜屏障与,PBP,结合,头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素,。,碳青霉烯类抗生素,亚胺培南，美罗培南等。尽管它们是,AmpC,酶的强诱导剂，但它们对,AmpC,酶高度稳定，能在诱导产生足量的,AmpC,酶之前快速地杀死细菌。同时亦能用于治疗产,ESBL,肠杆菌属细菌引起的医院感染。,降阶梯治疗,-,严重细菌感染新策略,第四代头孢菌素有明显的抗菌活性；,碳青霉烯类疗效最好（尤其合并,ESBLs,时）；,可根据药敏选用氨基糖苷类和喹诺酮类；,不宜使用三代头孢菌素及其复合制剂。,高产,AmpC,酶耐药菌的治疗总结,ARPAC,(,A,ntibiotic,R,esistance,P,revention,A,nd,C,ontrol),欧洲医院调查,FM,MacKenzie,，,Scotland,抗菌药使用策略,耐药性调查,抗菌药使用调查,感染控制策略,致力于：少用抗菌药,低的耐药率,病原菌的低播散率,合理应用抗菌药物，减少选择压力,阴沟肠杆菌等可表现为,AmpC,低水平持续表达，三代头孢菌素是弱诱导剂，,ampD,基,因自发突变率为,10,-5,10,-7,，可使细菌去阻遏,，导致酶的高表达,。三代头孢菌素的使用是导致,去阻遏突变株发生的重要因素，因此应尽量避免不必要和不适当的抗感染治疗。,严格执行消毒隔离制度,尤其要执行严格洗手制度,美国,Ohio,，,一家烧伤病房,1997,年春天，不动杆菌分离率突然增加,医护人员手病房计算机键盘被护理的病人,措施：,带手套使用计算机,离开病房换手套,计算机键盘清洁,限制！,高选择的抗菌药物,洗手！,Thanks!,