第6章 基因组.ppt

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 基因组,基因组：生物细胞中单套染色体的所含,DNA,序列的全部组成。,人类基因组：,22,条常染色体和,X，Y,染色体的,DNA,组成。,基因组大小,种类,Mb,大肠杆菌,4.64,啤酒酵母,12.1,线 虫,100,果 蝇,140,蝗 虫,5000,小 鼠,3300,豌 豆,4800,玉 米,5000,小 麦,17000,人,3000,C,值悖论,生物体单倍体,DNA,总量称为,C,值。,高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动，所以，理论上应该是它们的,C,值也,应该更高。但是事实上,C,值没有体现出与物种进化程度相关的趋势。高等生物的,C,值不一定就意味着它的,C,值高于比它低等的生物。这种生物学上的,DNA,总量的比较和矛盾，称为,C,值悖论。,分类最小基因组,支原体,0.58,X 10,6,细菌,2.8,X 10,6,酵母,3.0,X 10,7,霉菌,5.5,X 10,7,蠕虫,1.1,X 10,8,昆虫,0.5,X 10,9,鸟类,0.2,X 10,10,两栖类,0.1,X 10,10,哺乳类,2.8,X 10,10,进化地位高，结构复杂的生物的同类生物最小基因组比较，符合进化程度越高，生物基因组越大的规律。,DNA,序列的分类,基因序列和非基因序列,基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束的一段,DNA,序列，称为开放阅读框（,open reading frame,ORF）,非基因序列：基因序列以外的,DNA,序列。,编码序列和非编码序,编码序列：编码,RNA,和蛋白质的,DNA,序列。,非编码序：内含子和基因的间隔序列。,单一序列和重复序列,单一序列：基因组中只有一份的,DNA,序列。,重复序列：基因组中重复出现的序列。例如，,STR，SNP，,微卫星,DNA,等。,模式生物,在,某,一类生物中选取一种或几种生物作为代表进行重点研究,以了解这一类生物的共性和特征,常用模式生物:,线虫,果蝇,斑马鱼,小鼠,拟南芥,烟草,水稻,什么是基因？,基因在哪里？,寻找基因的思路：,基因定位,基因克隆,基因分离,将基因定位于染色体上,有大到小，由粗到细，精细定位,克隆目的基因片段,功能克隆,克隆（致病）基因的一种策略。,收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。,性状（疾病）,蛋白质产物（生物学功能）,从,氨基酸序列出发设计,DNA,引物，从文库调取基因,得到基因序列,染色体定位,疾病,功能,基因,分析异常基因的产物（蛋白质）：,纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线：,1.,进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从,cDNA,文库或基因组文库中筛选对应的编码基因；,将异常蛋白质制成相应的抗体，从,cDNA,表达文库中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过,DNA,序列分析确定导致疾病的分子缺陷。,绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白化病（,albinism）、,苯丙酮尿症（,phenylkeonuria,，PKU）,和镰刀形细胞贫血病（,sickle-cell disease）,等，都是采取的这一策略。,血红蛋白病,镰刀形细胞贫血症,正常,HbA,四条多肽链（,2,条,链，两条链）,定位克隆,又称为“逆向遗传学”，始于,20,世纪,80,年代后期,利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。,定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。,克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,疾病,遗传标记，染色体定位,基因,序列,mRNA,cDNA,蛋白质产物,生物学功能,疾病,基因,功能,定位克隆：通过遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得,cDNA,及全基因。,基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。,若多态标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离，呈“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈现“共分离”现象，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一,DNA,标记相连锁的基因。,将基因定位于染色体,特定区段2.,候选基因筛选鉴定,定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特定染色体上。,主要方法：,家系调查法,体细胞杂交法,核酸杂交技术,等等,A-1,型短指（趾）症法拉比（,Farabee,）,1903,年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的经典例子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。,贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个,A-1,型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在,2,q,35-36,区）、克隆，并首次发现了人,IHH,基因和该基因上的三个突变位点是导致,A-1,型短指（趾）症的直接原因。,用遗传标记进行基因定位,形态标记,morphological markers,细胞标记,cytological markers,生化标记,biochemical markers,分子标记,molecular markers,分子遗传标记,在核酸分子水平，对具有相对差异的等位基因,DNA,多态性的标记，广泛存在于高等生物编码区和非编码区，又称为,DNA,分子标记,，是,DNA,水平上遗传变异的直接反映。,特点,:,1.,直接以,DNA,形式表现，在生物体各发育阶段,各组织均可检测到。,2.,数量多，遍及整个基因组。,3.,多态性高，自然界存在许多等位突变，无需专门创造特殊的遗传材料,4.,中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁,5.,许多分子标记表现为共显性（,codominance,）,能够鉴别出纯合基因型与杂 合基因型，提供完整的遗传信息,分子遗传标记发展,RFLP,restrict fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性,SSLP,simple sequence length polymorphism,简单序列长度多态性,SNP,single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性,SSLP,simple sequence length polymorphism,简单序列长度多态性,，,又称为,VNTR,variable number tandem repeat,数目可变的串联重复多态性,指重复单位相对较小,由重复单位的序列差异和数目变化,可形成丰富的多态性。,包括,:,小卫星序列,minisatellite,微,卫星序列,microsatellite,小卫星,DNA,标记,minisatellite,，,核心序列为,11,60,bp,，,主要存在于染色体靠近端粒处，由于其拷贝数变化，在不同个体间中存在串联数目的差异，若在重复序列两侧有限制性内切酶酶切位点，则切下来的片段会呈现出多态性。可用,于,DNA,指纹，,DNA Finger,。,微卫星,DNA,标记,microsatellite,，,指以,27,个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列（微卫星,DNA,microsatellite,DNA，,又称为,STR short tandem repeat,短串联重复序列）,由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传。散布于整个基因组中,。,SNP,single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性，是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于,1,。,SNP,分为两种形式：,基因编码区,的,SNP，,称为,cSNP,遍布于基因组内的大量单碱基变异,SNP,分析的特点1）,SNP,数量大，分步密集，平均每,1000,bp,就有一个,SNP,（2）SNP,比,STR,扩增更有效，不会产生假带,（,3,）由于,SNP,是二态的，易于自动化批量检测，易于用计算机分析结果,SNP,与,RFLP,和,STR,等,DNA,标记的主要不同在于：,不再以“长度”的差异作为检测手段而是直接以序列的差异作为标记。,但,SNP,单个基因座的多态性很差，只有二态，为此采用多个,SNP,基因座进行“单倍型”分析十分重要。,SNP,是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，该项目研究是阐明基因组功能及特点的重要基础。,SNP,是人类基因组,DNA,序列变异的主要形式，是决定人类疾病的重要遗传基础,。,其他遗传标记举例,AFLP,amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性,RAPD random amplified polymorphism DNA,随机扩增多态性,SSCP,single strand conformation polymorphism,单链构象多态性,AFLP amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性,通过,DNA PCR,扩增基因,组,DNA,的模板，随后用电泳将扩增片段分离，,通过,DNA,谱带鉴别多态性,。,RAPD random amplified polymorphism DNA,随机扩增多态性,用于扩增多,态性,DNA,的引物是,随机的。在做多态性分析时，用一组引物（,20,40,个）在基因组全序列上扫描可获得基因组多态,性的丰富信息。,SSCP,single strand conformation polymorphism,单链构象多态性,是基于,PCR,扩增而新发展起来,的,DNA,多态性分析，利用,PCR,特异的扩增出基因组的目的,DNA,片段，变性后形成的单链,DNA,在自然条件下能形成一定的空间构象，并且这种空间构象由,DNA,链的碱基序列决定，若碱基发生变化，将在电泳图谱上表现出不同生物个体的特异性，即多态性。,用,原位杂交,in situ,hybridazation,和,荧光原位杂交,fluorescence in situ,hybridazation,FISH,进行基因定位：,将,DNA,探针用同位素或荧光染料标记，按照碱基互补配对原则，与固定在玻片上的中期染色体杂交后，在荧光显微镜下呈现不同颜色的荧光。,FISH,是一项十分灵敏的技术，可以检测出非整倍体，基因扩增，微小的染色体重排或易位,等染色体变异,原位杂交,基因定位,多色,FISH,M-FISH,技术,荧光原位杂交,FISH,在肿瘤发生发展相关染色体变异方面的研究应用：,比较基因组杂交技术,comparative genomic hybridization，,CGH,利用同一种生物异常细胞的基因组做探针，与正常细胞基因组杂交，通过对杂交信号分析，发现不同，寻找相关基因,。,利用,染,色体步,移,确定,基因位,置,定位候选,克隆,该方法是定位克隆的进一步发展,将疾病相关基因定位于染色体相关区域,该染色体区域得到若干候选基因,进一步分析得到目的,cDNA,蛋白质功能研究,疾病,染色体定位,若干候选基因,确定目的基因,蛋白质功能,筛选染色体定位只是定位克隆的第一步。由于筛选、确认的困难，使其成为定位克隆策略的“瓶颈”。目前获得基因序列的方法大致有,:,(1),对,50 0,的关键部位进行直接测序；,(2),比较基因组作图和测序；,(3),基因结构特征分析；,(4),捕获，主要有岛捕捉层析 法、外显子捕捉法、直接筛选法等方法,差异表达,原理,:,比较不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本,(,tester，,),和参照,(,driver，,),的蛋白质或,RNA,两者之间的差异，如缺失或特异表达部分，从而发现新基因,1.,差异性表达,mRNA,方法,（,1）,mRNA,差异显示（,mRNA-Differential,Display，mRNA-DD）,（2）,抑制性消减杂交（,Suppression Subtractive,Hybridization，SSH）,（3）,cDNA,代表性差异分析（,cDNA,Representational,Difference Analysis，cDNA-RDA）,（4）cDNA,microarray,2.,差异性表达蛋白质,消减杂交,（,subtractive,hybrization,）,利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，或者在不同发育阶段、不同状态下表达差异，通过其,mRNA,或单链,cDNA,进行杂交，除去两者之间相同的基因成分，使表达有差异的基因得到充分富集。它的实质是对两组基因转录本全面比较，去同存异，分离差异表达基因,Subtractive cloning,cDNA-RDA,技术,cDNA,-RDA（cDNA-Representative Difference Analysis）,技术是,1994年,Huband,和,Schatz,在,RDA,和,mRNA-DD,二者基础上建立的一种基因克隆新方法,在代表性差异分析基础上，以,mRNA,表达水平的差异为差减目标，因而兼有,RDA,和,mRNA-DD,的优点,这一方法克服了,mRNA-DD,假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定的工作量，但操作烦琐。,特点：,肿瘤组织,Driver,正常组织,Tester,AAA,AAA,mRNA,ds,cDNA,Mbo,I,酶切,连接接头,PCR,扩增,无接头,换新接头,杂交,无扩增,线性扩增,指数扩增,cDNARDA,方法简要示意图,因为同一种,mRNA,经不同的剪接或翻译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因组的基因数目。,蛋白质组研究常用方法：,二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，质谱分析等等。,差异性表达蛋白质,生物信息学方法,通过序列的,ORF,预测,建立,cDNA,文库,差减杂交得到均质化文库,cDNA,序列测定,生物信息学分析，,ORF,预测,同源性比较，功能预测,生物信息学（,bioinformatics）,是生物学，计算机科学，以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。,以计算机为主要工具，开发各种软件，对日益增长的,DNA,和蛋白质的序列和结构等相关信息进行收集、储存、发行、提取、加工、分析和研究，同时建立理论模型，指导实验研究。,由数据库、计算机网络和应用软件三大部分构成，在基因组计划中发挥不可替代的作用,该定义包含两方面的内容,一方面是发展强大有效的信息分析工具，构建适合于基因组研究的数据库，用于搜索、管理、使用人类基因组和模式生物基因组的巨量信息；,另一方面是配合实验研究，确定约,30,亿个碱基对的人类基因组完整核苷酸顺序，找出人类全部约,10,万个基因在染色体上的位置以及包括基因在内的各种,DNA,片段的功能。,该定义包含两方面的内容,一方面是发展强大有效的信息分析工具，构建适合于基因组研究的数据库，用于搜索、管理、使用人类基因组和模式生物基因组的巨量信息；,另一方面是配合实验研究，确定约,30,亿个碱基对的人类基因组完整核苷酸顺序，找出人类全部约,10,万个基因在染色体上的位置以及包括基因在内的各种,DNA,片段的功能。,通过,EST,拼接,如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列,用该小鼠,cDNA,比对人的,EST,数据库,得到一簇,EST,后，将相邻的,EST,通过相互重叠部分进行拼接。,得到人对应的完整,cDNA,的序列后，两端设计引物在,cDNA,文库中进行,PCR，,得到该,cDNA,的,克隆。,至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。,EST,拼接实例,小鼠基因比对人,EST,的结果。通过这一簇,EST,可拚接出对应的人全长,cDNA,基因芯片技术的应用,使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，绝大部分工作都是繁琐重复劳动,。,通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。,