常用分子标记技术原理及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,常用分子标记原理与应用,知识框架,生化标记,分子标记,细胞学标记,形态,学,标记,遗传标记,RFLP,RAPD,AFLP,SSR,ISSR,SNP,常见分子标记,什么是遗传标记（Genetic Marker）,?,遗传标记指可追踪,染色体,、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即,可遗传性,和,可识别性,，因此生物的,任何有差异表型的基因突变型,均可作为遗传标记。,遗传标记的类型主要有四大类：,1,.,形态标记,(,morphological marker,),2.,细胞学标记(,cytological marker,),3.,生化标记,(,biochemical marker,),4.,分子标记,(,molecular marker,),主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。,优点,:,形态学标记简单直观、经济方便,。,缺点,:(1),数量在多数植物中是很有限的,;(2),多态性较差，表现易受环境影响,;(3),有一些标记与不良性状连锁,;(4),形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程周期较长,。,形态学标记,形态标记（,Morphological marker,）,形态学上如何区分,植物细胞染色体的变异：,包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（,C,带、,N,带、,G,带等）的变化。,优点,:,能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位,。,缺点,:,(1),材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大,。,(2),有些变异难以用细胞学方法进行检测,。,细胞学标记,人类22对常染色体,细胞分裂中期（Metaphase）,染色体组karyotype(Chromosome phenotype),analysis,细胞学标记,概念：,主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。,种类：,可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）。,同工酶（isoenzyes)：,催化功能相同，但结构和,生理性质不同的一类酶,。,生化,标记的优点：,数量更丰富，受环境影响更小。,生化,标记的缺点：,蛋白质受生物体发育的时空影响很大,。,生化标记（,Biochemical Marker,）,主要内容：,一、,分子标记的相关概念及分类,二、几种常见分子标记的原理及方法,三、分子标记技术的应用,分子标记技术,分子标记,来源于,DNA,水平的突变,突变(Mutation),：,是指DNA水平的,可遗传的变异，,不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。,可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。,多态性(Polymorphism),：,群体内,同一DNA序列,的两种或,多种变异形式,，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每100010000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。,1.广义的分子标记,(molecular marker),是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。,eg:,蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）,2.狭义的分子标记,（DNA marker),概念只是指DNA标记,能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,一,.,分子标记相关概念,分子标记的,概念：,是以,直接检测DNA核苷酸序列的差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。,分子标记（DNA marker）,分子标记的特点：,(相对形态，细胞，生化标记具有的优点),（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；,（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；,（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；,（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。,在遗传学研究中广泛应用的,DNA,分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：,第一类：,是,以分子杂交为核心,的分子标记，包括,RFLP,、,DNA,指纹技术等，这类分子标记被称为,第一代分子标记；,第二类：,是,以,PCR,为核心,的分子标记，包括随机扩增多态性,RAPD,、简单序列重复,SSR,、扩增片段长度多态性,AFLP,、序列标签位点,STS,等，为,第二代分子标记；,第三类：,是一些,新型的分子标记,，如：,SNP,标记、表达序列标签,EST,标记等，也以,PCR,技术为基础，为,第三代分子标记,。,分子标记的分类,英文缩写,英文名称,中文名称,RFLP,Restriction fragment Iength,polymorphism,限制性片段长度多态性,STS,Sequence tagged site,序列标签位点,RAPD,Random amplified polymor-,phic DNA,随机扩增多态性,DNA,AFLP,Amplified frangment length,Polymorphism,扩增片断长度多态性,SSR,Simple sequence repeat,简单序列重复,SNP,Simple mucleotide polymor-,phism,单核苷酸多态性,几种主要的分子标记,1.RFLP,2.RAPD,3.AFLP,(,),4.SSR,5.ISSR,(,),6.SNP,二、几种常见分子标记的原理及方法,AFLP,扩增片段长度多态性标记,(,Amplified Fragment Length Polymorphism,),起源：,1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。,定义,:,由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。,核心技术：,AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。,AFLP的原理Principle of AFLP,基本原理：,对基因组DNA用两种限制性内切酶,进行,消化，连上相应的双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在3端添加1-2个随机碱基对酶切连接后的DNA进行选择性扩增。此后再进行第二次PCR扩增，所用的引物是在第一次PCR中使用的选择,性,引物的3端又附加了1-3个随机碱基。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。,多态性源自限制性酶切位点的变异。,AFLP,的实验操作,Procedures for AFLP,AFLP技术,主要包括模板,DNA制备、引物设计、,酶切片段扩增及凝胶电泳分析,4个步骤。,各步骤具体的过程有：1.,DNA模板酶切和接头连接（EcoRI/MseI）,2.,在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。,3.,PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上,电泳,。,4.,多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。,基,本,步,骤,AFLP,DNA,提取,两种限制性内切酶酶切,DNA,寡聚核苷酸接头的连接,对限制性酶切片段的选择性扩增,扩增产物的电泳分析,AFLP,技术路线,1.,基因组,DNA,被酶切成小片段：,通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如,MseI,和一个六个碱基识别位点的酶如,EcoRI,，其中,MseI,确保产生合适大小的,DNA,片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶,EcoRI,能够限制扩增片段数目，确保,DNA,多态性的正常检测；,2.,接头与酶切片段的连接：,接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，,MSE,接头和,ECORI,接头，核心序列是一段已知的,20,核甘酸的,DNA,序列；,3.,预扩增：,应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为,EcoRI,切点，一端为,MseI,切点的,DNA,酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的,DNA,序列才能被扩增。,1,3,步的产物可以通过,Agarose,胶检测。,4.,选择扩增：,应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。,AFLP的原理,Principle of AFLP,DNA,提取,两种限制性内切酶酶切,DNA,寡聚核苷酸接头的连接,对限制性酶切片段的选择性扩增,扩增产物的电泳分析,AFLP,结合了,RFLP,和,RAPD,两种技术的优点,1、具有分辨率高,2、稳定性好,3、效率高的优点,AFLP特点,1、试验成本高,2、对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高,缺点：,优点：,S,imple,S,equence,R,epeat,基本原理,：,微卫星,DNA,是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在,1,10bp,之间，常见的微卫星如,TGTG,TG=(TG)n,或,AATAAT,AAT=(AAT)n,等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个,SSR,序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个,SSR,座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解,SSR,座位的侧翼序列,(Flanking Region),，寻找其中的特异保守区。,SSR,分,子,基,础,SSR,基,本,步,骤,SSR,DNA,酶切,收集酶切片段连接载体,合成末端标记的,SSR,探针,筛选含,SSR,的阳性克隆用于测序,根据测序结果设计引物进行,PCR,扩增,SSR,优点,:,数量丰富，广泛分布于整个基因,共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子,实验重复性好，结果可靠,所需,DNA,量少，对,DNA,质量要求不高,缺点：,由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，对于许多物种需构建文库，因此其开发有一定困难，费用也较高。,SSR,I,nter,S,imple,S,equence,R,epeat,by Zietkiewicz et al.,(1994),基本原理,：在,SSR,的,5,或,3,端加锚,l,4,个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列,SSR,的一段基因组,DNA,序列进行扩增。在,SSR,的,3,端或,5,端锚定,1-4,个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了,SSR,在基因组上的滑动大大提高了,PCR,扩增的专一性。,ISSR,分,子,基,础,ISSR,银杏,5,个群体,66,个个体进行扩增的,13,种有效,ISSR,引物的特点,ISSR,图 引物,UBC845,扩增群体,15,棵植株基因组,DNA,的,ISSR,电泳图,ISSR,