细菌培养及检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌及其培养和检测的学习汇报,目录,第一讲微生物细菌学,第二讲细菌培养,第三讲大肠杆菌,第四讲金黄色葡萄球菌,第五讲真菌学及其检测,第六讲微生物学及其检测,第一讲 微生物细菌学,细菌的定义,细菌的形态,细菌的结构,细菌的生理,细菌的定义,细菌是一类具有细胞壁的单细胞原核型微生物。通常使用显微测微尺来测量细菌的大小，以微米（,m,）,作为测量单位,细菌的形态,1.,球形 双球菌：肺炎双球菌,2.,链球菌：乳酸链球菌,3.,葡萄球菌：金黄色葡萄球菌,细菌的结构,基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质,特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,球菌形态,细菌的结构及功能,基本结构由外到内细菌的依次是,细胞壁,、,细胞膜,、,细胞浆,和核质,。,特殊结构有,荚膜,、,鞭毛,、,菌毛和芽孢,。,其中能维持细菌的固有形态的结构是,细胞壁,，,控制遗传性状的是,核质,，,与细菌的毒力有关的结构是,荚膜和菌毛,，,抵抗力强,的是,芽孢,，,决定细菌有无运动性的结构是,鞭毛,。,芽孢,菌体,细菌的生理,水分（,70,90,）：游离水和结合水,固形物,(10,30,）：有机物（蛋白质、核酸、糖类、脂类、其他）和无机物,细菌的化学组成,1,、自养菌：自养菌,具有完备的酶系统,，合成能力较强，能以简单的,无机碳化物作为碳源,，合成菌体所需的有机物质。,2,、异养菌：异养菌,不具备完备的酶系统,，合成能力较差，必须利用,有机物作为碳源,，其代谢所需能量大多从有机物氧化中获得。,致病菌多属异养菌，寄生菌多属自养菌。,细菌的营养类型,水、含碳化合物、含氮化合物、无无机盐,细菌的营养物质,1,、细菌繁殖生长的条件：营养物质（五种营养成分）、温度（最适生长温度,37,）、,pH,（最适,7.2,7.6,）、渗透压（多在等渗条件下）、气体（根据细菌呼吸类型）,2,、细菌的繁殖方式：简单的二分裂,细菌的生长繁殖,第二讲 细菌培养,根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的,PH,。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。配置好的培养基必须经过灭菌。,对不同的材料应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压灭菌锅内，通过加热是锅内的冷空气排进以后。关闭排气阀并继续加热，这是锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰灼烧灭菌的。将某种菌种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现一定的形态特征。,1,、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配置，了解配置培养基的一般步骤和方法。,2,、了解灭菌的基本原理，以及实验中常用的灭菌方法。,3,、初步学会细菌培养的基本技术。,一、细菌培养的实验原理,二、目的要求,大肠杆菌的生长状态,芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。,天平、角匙、,200mL,烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密,pH,试纸（或,pH,计）、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱,NaCl,、,1mol/L,的,NaOH,溶液、体积分数为,75%,的酒精溶液、蒸馏水。,三、材料用具,四、细菌培养的方法和步骤,（五）、培养,（四）、接种,（三）、搁置斜面,（二）、灭菌,（一）、培养基的配置,用天平称取,0.5g,牛肉膏、,1g,蛋白胨、,0.5gNaCl,、,2g,琼脂。将称好的牛肉膏、蛋白胨和,NaCl,放入烧杯。,称量,向上述烧杯中加入蒸馏水,100ml,，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热，在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂安全溶化后，补加蒸馏水至,100ml,。,溶化,用滴管逐滴滴入,1mol/L,的,NaCl,溶液，边滴边搅拌，并随时用,pH,试纸测,pH,，直到,pH,为,7.47.6,为止。,调,pH,将培养基趁热分类到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的,1/5.,注意,:,分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。,分装,培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的,2/3,哎试管口内。,加棉塞,（一）、培养基的配置,每,10,支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。,包扎,1,打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水（最好用开水），水面与底架平齐为宜。,2,3,4,5,6,排出锅内的冷空气。接通电源，当压力上升到,49KPa,时，打开排气阀放气，当压力降到,0,是时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。,当锅内的压力上升到,98KPa,时，控制火力大小，使压力维持在,98KPa,左右,20min,。切断电源。,将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则影响灭菌效果。,加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。,当压力降至,0,以后，打开排气阀，,10min,以后，旋松紧固螺栓，取出试管。最后。将灭菌锅里的水排放干净。,（二）、灭菌,（三）、搁置斜面,当培养基冷却,50,左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,（四）、接种,1,3,2,4,5,用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精（,75,）棉球擦拭双手,。,当手上的酒精挥发完毕以后，点燃酒精灯。注意：一定要等手上的酒精挥发完毕后，在点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。,接种 注意：整个实验操作过程都要小心谨慎，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。,（,1,）用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞，不取下。,（,2,）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。,（,3,）在火焰边取下两个棉塞，不能放下,;,烧灼管口一周。,（,4,）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。,（,5,）在火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线。,（,6,）抽出接种环后。烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。,熄灭酒精灯。实验后的带菌培养基，如果用的是致病菌，必须经高压蒸汽灭菌后方可倒掉；如果是非致病菌，也要经过加热后再倒掉。,接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上。,（五）、培养,将接种后的试管放入恒温箱内，在,25,下培养,5,7d,或在,37,下培养,24h,。,五、结论,观察斜面培养基上的细菌生长状况如何？,细菌在液体培养基中生长后，常出现混浊，沉淀或形成菌膜。,细菌接种在固体培养基上，经过一定时间的培养后，表面出现肉眼可见的单个细胞集团，称为菌落。,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落、菌苔,六、讨论,问题,答案,1.,在高压灭菌开始之前，为什么要排尽灭菌锅内的冷空气？,在高压锅灭菌以前，如果国内的冷空气没排尽，当压力上升到,98KPa,，锅内的温度就不会达到应有的温度，导致灭菌不彻底。,2.,灭菌完毕以后，如果压力未降到,0,就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？,如果压力未降到,0,就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口，这是因为高压蒸汽灭菌锅内外的压力不平衡所致。,3.,这种操作为什么一定要在火焰旁进行？,空气中存在有大量的微生物，而接种灯得火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染。,第三讲 大肠杆菌,定义,革兰氏阴性短杆菌，大小,0.51,3,微米。周身,鞭毛,，能,运动,，无,芽孢,。能发酵多种,糖类,产酸、产气，是人和,动物,肠道中的正常栖居菌,特性,大肠杆菌是细菌，属于,原核生物,；具有由,肽聚糖,组成的,细胞,壁，只含有,核糖体,简单的细胞器，没有细胞核有,拟核,；细胞质中的质粒常用作基因工程中的,运载体,。,代谢,大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。,大肠杆菌,1,、,培养：在,LB,液体培养基上扩大培养,2,、分离：,灭菌,倒平板,培养,划线分离,LB,液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌,将固体培养基倒入,4,个灭菌后的培养皿中，制备平面培养基,在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养,12h,平板划线法,培养皿倒置，,37,恒温培养,1224,小时,大肠杆菌的培养和分离,菌种保存,培养基的配制,灭菌,超净工件台,倒平板,接种液体,培养,划线分离,培养,大肠杆菌检测方法和步骤,方法：,用平板涂布法将样品稀释后（每个水样做,3,个浓度）涂布到伊红美蓝培养基后，待长出菌落，观察符合特征的群落，计算菌落数目，从而求出总数目。,培养基成分及其配置,1,、成分：蛋白胨,10g,、乳糖,10g,、磷酸氢二钾,2g,、琼脂,2030g,、蒸馏水,1000ml,、,2%,伊红水溶液,20ml,、,0.5%,美蓝水溶液,13ml,2,、配置方法：先将琼脂加至,900ml,蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至,1000ml,，调整,PH,为,7.27.4,。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以,115,灭菌,20min,，冷却备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至,50,55,，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。,实验步骤,涂布平板法,1,以无菌操作将检样,25mL(,或,g),放于有,225mL,灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内,(,瓶内予置适当数量的玻璃珠,),或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成,1:10,的均匀稀释液。以,8 000-10 000 r/min,的速度处理,1min,做成,1:10,的均匀稀释液。,2,用,1mL,灭菌吸管吸取,1:10,稀释液,1mL,注入含有,9mL,灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成,1:100,的稀释液。,3,另取,1mL,灭菌吸管,按上条操作依次做,10,倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用,1,支,1mL,灭菌吸管。,4.,将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取,0.1ml,菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上,2030min,，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。,涂布平板操作,第四讲 金黄色葡萄球菌,概括,葡萄球菌属微球菌科，本菌有,19,个菌种，从人体上可检出,12,个种。,葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。,金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。,易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。,需氧或兼性厌氧。,最适生长温度,37,，最适生长,pH 7.4,。,耐盐性强，在含,10,15%,的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。,在普通营养琼脂平板上培养,18,24,，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。,培养特性,在血平板上可形成明显透明的溶血环。为,型溶血。,可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。,大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、,VP,试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。,检测方法,材料与方法,1,、材料,培养基：,7.5%NaCl,肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）,试剂：,7.5%NaCl,肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，,Baird-Parker,琼脂平板，生理盐水，兔血浆（,1,：,4,），,器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，,L,型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，,1ml,注射器，,实验动物：健康的小白鼠,2,、方法,待检样品,25g+225ml,灭菌生理盐水,直接计数法 增菌培养方法,Baird-Parker,琼脂平板,7.5%NaCl,肉汤培养基,血平板 血平板,涂片染色镜 溶血观察动物接种试验 血浆凝固试验,报告,第五讲 真菌学及其检测,1,、真菌是一类具有细胞壁，不含叶绿素，无根、茎、叶的分化，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。异养型。真菌种类多，有,10,余万种，大多对人体无害，有的甚至有益。繁殖方式两种：即无性和有性繁殖。还有少数真菌，能致人、动植物发病，称为病原性真菌。,一、真菌学,2,、分类：,酵母菌,霉菌,担子菌,真 菌,二、检测,标本,直接镜检,墨汁染色,乳酸酚棉蓝染色,不染色,抗原检出,分离培养,二相性真菌,氢氧化钾消化后涂片镜检,脑心浸液,病原性真菌,脑心浸液,沙氏培养基,血琼脂平板,观察菌落性状和菌丝孢子形态,显微镜检查,湿片法或直接涂片高倍视野镜检，见有菌丝孢子或单细胞真菌（有诊断价值，但不能确定真菌种类）,第六讲 微生物学及其检测,一、微生物学,1,、,微生物是指广泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。,2,、微生物特性,主要有四个方面,种类多,分布广,繁殖快,易变异,3,、微生物的形态结构,4,、微生物的化学组成,C,，,H,，,O,，,N,，,P,，,S,以及其他元素,5,、微生物的营养物质,1,水和,无机盐,2,碳源,:,凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质,3,氮源：凡能为微生物提供所必需氮元素的营养物质,来源：周围环境中得有机 无机含氮物质,作用,:,主要用于合成蛋白质，核酸以及含氮的,代谢产物,4,能源,:,能为微生物生命活动提供最初能源来源的营养物质或辐射能,5,生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物,6,、微生物检测步骤,一、液体样品：,1,、打来紫外灯灭菌,30min,2,、把所有做诶生物的物品一并带入无菌室,3,、用酒精棉对手进行消毒，取出灭菌平皿并编号（根据本厂的菌落数进行编号）以下样液的菌落数小于,100,4,、用灭菌吸管吸取,1ml,灭菌盐水放入编号为,“,0,”,的平皿中,5,、哟偶那个灭菌吸管分别吸取,1ml,样品放入编号为原液的两个平皿中（若盛装样液的容器诶桶装则应先把样液转入灭菌容器中再进行取样）,6,、吸取样液,1ml,放入灭菌的,9ml,盐水中，摇匀后分别放入编号为,-1,的两个平皿中,7,、点燃酒精灯，倒入温度在,46,（不低于,40,）的营养琼脂，摇匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为,36,1,的培养箱中培养,48h,2h,8,、吸取样液,10ml,放于,3,支双料管中,9,、吸取样液,1ml,放于,3,支单料管中,10,、吸取样液,0.1ml,放于,3,支单料管中,11,、把,8,、,9,、,10,所得最终溶液摇匀放置于温度为,36,1,的培养箱中培养,24h,1h,12,、观察,7,、,11,的结果并记录,二、固体样品：,1,、打开紫外灯灭菌,30min,2,、把所有做微生物的物品一并带入无菌室,3,、用酒精棉对手进行消毒，取出灭菌平皿并编号（根据本厂的菌落数进行编号）,4,、用灭菌吸管从,226ml,盐水瓶中吸取,1ml,灭菌盐水放入编号为,“,0,”,的平皿中,5,、称取磨碎或搅碎的样品,25g,放入,225ml,盐水瓶中，摇匀（此步得到样品稀释,10,倍的溶液，即,“,-1,”,溶液）,6,、用灭菌吸管分别吸取,1ml,“,-1,”,溶液放入编号为,“,-1,”,的两个平皿中,7,、吸取,“,-1,”,溶液,1ml,放入灭菌的,9ml,盐水中，摇匀（此步得到：,-2,“,溶液）,8,、分别吸取,1ml,”,-2,“,溶液放入编号为,”,-2,“,的两个平皿中,9,、点燃酒精灯，倒入温度在,46,（不低于,40,）的营养琼脂，摇匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为,36,1,的培养箱中培养,48h,2h,10,、吸取,”,-1,“,溶液,10ml,放于,3,支双料管中,11,、吸取,”,-1,“,溶液,1ml,放于,3,支单料管中,12,、吸取,”,-1,“,溶液,0.1ml,放于,3,支单料管中,13,、把,8,、,9,、,10,所得最终溶液摇匀放置于温度为,36,1,的培养箱中培养,24h,1h,14,、观察,7,、,11,的结果并记录,谢谢！,