第14章基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,Dolly,the first mammal to be cloned from an adult cell,Is shown here with her naturally conceived first lamb,Bonnie.,卵细胞,（去核）,B,乳腺细胞,（,6,岁羊）,A,细胞融合,电脉冲,胚胎细胞,转移,子宫内发育,C,Dolly,的一生,1996,年,7,月,5,日，生物学界发生了一件轰动世界的大事：克隆羊多莉诞生。,1997,年,2,月,27,日，英国,自然,杂志全文刊登罗斯林研究所的实验结果。,1998,年,4,月,13,日凌晨时生下一只雌性的体重,2.7,千克的小羊羔，取名“邦妮”。,1999,年，多莉一家又迎来了,3,个可爱的羊宝宝。,2003,年,2,月,14,日，英国一个名叫多莉的克隆羊，因患严重肺病而接受“安乐死”。,第 二 节,重组,DNA,技术,DNA Recombination Technique,相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,基本原理,重组,DNA,技术与医学的关系,本节主要内容,一、重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为,克隆化,(cloning),，,即,无性繁殖,。,（一）,DNA,克隆,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),即,DNA,克隆,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,应用酶学的方法，在体外将各种来源的,遗传物质,（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的,DNA,）,与载体,DNA,接合,成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(,replicon,),，,继而通过,转化或转染,宿主细胞，,筛选,出含有目的基因的转化子细胞，再进行,扩增,提取获得大量同一,DNA,分子，也称,基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,DNA,克隆,(DNA cloning),（二）工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,T4DNA,连接酶,逆转录酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,-,“,缝纫针”,-,“,基因剪刀”,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,35,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,-“,基因剪刀”,定义,限制性核酸内切酶,(,restriction,endonuclease,RE,),是,识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围,切割,双链,DNA,的一类内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,Bam,H,作用,与甲基化酶共同构成细菌的,限制修饰系统,，限制外源,DNA,，,保护自身,DNA,。,分类,、,、,（基因工程技术中常用,型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口,：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,GGGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,blunt end,粘端切口,sticky end,同功异源酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称,同功异源酶,。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生,相同的粘性末端,，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,（三）目的基因（,target DNA,）“乘客”,cDNA,(complementary DNA),反转录合成，与,mRNA,互补的单链,DNA,基因组,DNA(genomic DNA),一个细胞或生物体整套遗传信息的所有,DNA,序列,（四）基因载体,“,交通工具汽车”,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,载体的选择标准,能自主复制；,具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为,多克隆位点（,MCS,）,；,分子量小,，,以容纳较大的外源,DNA,。,1.,质粒,(plasmid),质粒：存在于细菌染色体之外的能独立自主复制环状双链,DNA,分子。带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状,目 录,ori,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,2.,噬菌体,(,phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因的,N,端）,M13mp,系列,pUC,系列,3.,粘性质粒,(,cosmid,),一种人工构建的克隆载体，包含了,噬菌体的,cos,基因。能被包装到,噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的,DNA,片段（超过,45kb,）要比质粒载体携带的要大,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),动物病毒,DNA,改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,二、重组,DNA,技术基本原理,基本,过程,目的基因的获取,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,目 录,（一）目的基因的获取,1.,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。小分子多肽基因,2.,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),3.,cDNA,文库,(cDNA library),4.,聚合酶链式反应,(polymerase chain reaction,PCR),（见第,22,章）,1*,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,基因组,DNA,文库（,genomic DNA library,）,将某一基因组,DNA,用适当的限制酶切断后，与载体,DNA,重组，再全部转化宿主细胞，,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,称为,G,文库,2*,从基因组,DNA,文库获取目的基因,cDNA,文库,(,cDNA,library),：,以某种细胞的全部,mRNA,为模板，利用,逆转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,（,cDNA,）,再复制成双链,cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含,全部表达基因,的种群，称为,C-,文库,(,cDNA,library),。,C-,文库具有组织细胞特异性,。,3*,从,cDNA,文库获取目的基因,DNA,文库,目 录,Dr.,Karry,Mullis 1985,年发明，获,1993,年度诺贝尔化学奖,PCR,(Polymerase chain reaction),是用一对寡聚,DNA,作为引物，通过加温变性退火,DNA,合成的多次循环，使目的,DNA,片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经,25,30,个循环后，扩增倍数可达,10,6,。,4.,聚合酶链式反应,目的,:,用于扩增位于两段已知序列之间的,DNA,区段。,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系及基本反应步骤,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,（三）外源基因与载体的连接,1.,粘性末端连接,方式,：,(1),同一限制酶切位点连接,(2),不同限制酶切位点连接,配伍末端连接,非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,目 录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco,R切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R,+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,2.,平端连接,适用于：,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,目 录,3.,同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal,transferase,),的,作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,目 录,4.,人工接头,(linker),连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,REco,R,目 录,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式,转化,(transformation),转染,(,transfection,),感染,(infection),（四）重组,DNA,导入受体菌,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,原位杂交,Southern,印迹,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,a,互补,目 录,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,目 录,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,原核表达体系,真核表达体系,标准：,选择标志 强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,原核表达体系,（,E.coli,表达体系最为常用）,E.coli,表达体系的不足,不宜表达真核基因组,DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原,cDNA,的表达和分泌,目 录,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,使用穿梭载体，有两套复制原点及选择标记,缺点：,操作技术难、费时、不经济,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体,pFASTBACI,的物理图谱,目 录,（一）疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生,物制药,分子医学,molecular medicine,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(,bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,目 录,基因诊断,(genetic diagnosis),是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定,DNA,的异常,分离,、,扩增待测的,DNA,片断,一种可靠的,DNA,诊断方法应符合：,能正确扩增靶基因；,能准确区分单个碱基的差别；,本底或噪声低，不干扰,DNA,的鉴定,;,便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义,基因治疗,(gene therapy),是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗,(germ line gene therapy),1.,产前诊断,2.,携带者测试,3.,症候前诊断,4.,遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,小 结,1.,重组,DNA,技术（基因工程）：,分、切、接、转、筛,2.,分子医学涉及的内容,