第五章 固定化酶和细胞.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell,固定化酶和细胞,制作：郑穗平,酶应用过程中的主要瓶颈,酶的稳定性较差,：,除了某些耐高温的酶，如,-,淀粉酶、,Taq,酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的,pH,条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。,酶的一次性使用,：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。,产物的分离纯化较困难,：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,Contents of chapter 5,1,、什么是固定化技术和固定化酶,2,、固定化酶的研究历史,3,、酶的固定化技术,4,、固定化酶的特点,Go,Go,Go,Go,6,、细胞、原生质体的固定化，自学,5,、固定化酶的应用,Go,1,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶,（固定化酶）,固定化技术,化学偶联,酶,固定化,间歇,可溶,交联,包埋,吸附,间歇,连续,酶的固定化技术和固定化酶,固定化酶的三种形式,固定化酶：经提取和分离纯化后的酶,固定化菌体,(,死细胞,),：含酶菌体或菌体碎片,固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞,优点,：,不溶于水，易于与产物分离；,可反复使用；,可连续化生产；,稳定性好。,缺点：,1.,固,定化过程中往往会引起酶的失,活,2.,固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻,固定化酶的研究从,50,年代开始，,1953,年德国的,Grubhofer,和,Schleith,采用,聚氨基苯乙烯树脂,为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。,60,年代后期，固定化技术迅速发展起来。,1969,年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用,固定化氨基酰化酶从,DL-,氨基酸连续生产,L-氨基酸,，实现了酶应用史上的一大变革。,在,1971,年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为,Immobilized enzyme,。,2,固定化酶的研究历史,随着固定化技术的发展，出现,固定化菌体,。,1973,年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产,L-,天门冬氨酸。,在固定化酶和固定化菌体的基础上，,70,年代后期出现了,固定化细胞,技术。,1976,年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，,1978,年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。,1982,年，日本首次研究用,固定化原生质体,生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。,本章,目录,3,酶固定化技术,活性中心,：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。,功能基团,：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合,酶的高级结构,：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。,固定化酶操作的注意事项,酶和细胞固定化的模式,吸附法,利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。,常用的固体吸附剂有,活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石,等。,操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。,由于靠物理吸附作用，,结合力较弱,，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。,包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。,包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。,根据载体材料和方法的不同，可分为：,凝胶包埋法：,将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。,半透膜包埋法：,将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等,首先被采用包埋法的酶有：,固定化胰蛋白酶,固定化木瓜蛋白酶,固定化,淀粉酶,Enzyme+N,N-,甲叉双丙,烯,酰胺，丙烯酰胺，引发剂,海藻酸钙包埋法装置,将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用,CaCl,2,溶液使海藻酸钠中的,Na+,，部分被,Ca2+,所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。,颗粒大小可实时监控,脂质体包裹酶,结合法,选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。,根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：,离子键结合法：,通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有,DEAE-,纤维素,、,TEAE-,纤维素,、,DEAE-,葡聚糖凝胶,等。,共价键结合法：,通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：,纤维素,、,琼脂糖凝胶,、,葡聚糖凝胶,、,甲壳质,、,氨基酸共聚物,、,甲基丙稀醇共聚物,等。,酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使,载体活化,，,交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。,戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，,形成席夫（,Schiff,）碱,，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。,交联法制备的固定化酶或固定化菌体,结合牢固,，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使,酶活力损失较大,，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的,颗粒较小,，给使用带来不便。为此，,可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短,。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。,酶分子；（,a,）,酶分子之间用双功能基团的化学交联,试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（,b,）酶分子被,偶联到水不溶性载体上,形成水不溶性的固定化酶,本章,目录,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联,酵母细胞表面展示技术,N,H,C,H,2,C,H,2,O,P,O,O,O,N,H,2,O,H,O,O,H,O,H,O,H,O,P,O,O,O,C,H,2,C,H,C,H,2,6,R1-2Mana,1-2Mana1-6,R2,Mana1-4Glc,a1-,Plasma membrane,Protein,Ethanalamine phasphate bridge,Glycan,Inositol,脂肪酶在毕氏酵母表面展示与筛选,C.,antarctica,脂肪酶,B,及,M.,miehei,脂肪酶基因在酵母细胞表面的展示,4,固定化酶的特性：,将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，,酶的特性可能会有些变化。,固定化酶的,稳定性,一般比游离酶的稳定性好。,固定化酶的,最适作用温度,一般与游离酶差不多，,活化能,也变化不大。,酶经过固定化后，其作用的,最适,pH,值,往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适,pH,值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。,固定化酶的,底物特异性,与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。,固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。,本章,目录,乙酰,-DL Ala L Ala+,乙酸,乙酰,-D Ala,Aminoacylase,氨 基 酰 化 酶,5,固定化酶的应用,世界上第一种工业化生产的固定化酶。,1969,年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用,DEAE-,葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将,L-,乙酰氨基酸水解生成,L-,氨基酸，用来拆分,DL-,乙酰氨基酸，连续生产,L-,氨基酸。剩余的,D-,乙酰氨基酸经过消旋化，生成,DL-,乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的,60,左右。,泵,储,罐,反应产物,离心机,消旋反应器,固定化酶柱子,晶体,L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala,A-D-Ala,DL-,乙酰氨基酸拆分,高果糖浆的生产,世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含,葡萄糖异构酶,的放线菌细胞用,60,65,热处理,15min,，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。,2026/5/27 周三,生产果葡糖浆的固定化酶反应器,K.Buchholz,et al.(Germany),2005;2008,This is the largest process performed with about,1500 t,of immobilized enzymes producing a glucosefructose syrup(HFCS,high fructose corn syrup)with more than,10 million t of product(dry matter)per year,Typical fixed bed reactor,1220 t(dry substance,d.s.)per kg of,biocatalyst with a half-life of 80150 days.Reactor dimensions typically are,1.5 m diameter and 5 m height,of fixed bed bioreactors,with operation at 5860 C,青霉素酰化酶转化,填充床反应器连续生产,(R)-1,3-,丙二醇,b.,固定化生物催化剂在异丙醇,-,水溶液体系中进行不对称氢转移生物还原,底物,4-,羟基,-2-,丁酮,5%,产物,(R)-1,3-,丁二醇,49.5 g/l,光学纯度,99%e.e.,转化率为,99%,反应器稳定工作,500 h,反应器的生产率约为,750 mg/h/10 ml,(,催化剂,),（,Nobuya Itoh,2007,）,a.,固定化,E.coli,细胞,生物催化不对称氧化还原,CO,2,合成甲醇,（,Ei-Zahab,et al.2008,；,Matsuda T.et al.2009,）,四种酶,，,包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脱氢酶,共固定化在一种颗粒上,辅酶,NADH,固定在另颗粒上,向两种固定化颗粒的悬浮液中通,CO,2,气体进行反应,实现了辅酶的内部循环,该固定化系统表现出较好的循环使用的稳定性,酶和辅酶共固定化,E,1,E,2,环氧琥珀酸水解酶生产,L,-(+)-,酒石酸,江苏,常茂生化,常茂生化,利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的整细胞催化转化生产,L-(+)-,酒石酸，年生产规模,6000,吨，占世界市场,15%,，改变了传统从葡萄酒石提取的单一技术局面。,获得高酶活固定化细胞，单元反应柱生产能力增加,50%,，酶反应半衰期,8,个月以上，并且是世界上最大型的凝胶包埋固定化微生物细胞生产装置,大型固定化细胞装置,底物,产物,31,交联链孢霉菌细胞拆分,DL-,泛解酸内酯,交联,提高酶在有机底物体系中的稳定性,浙江鑫富,利用戊二醛交联固定化的链孢霉菌细胞,(,含内酯水解酶,),催化拆分,DL-,泛解酸内酯，已实现,D-,泛酸钙和,D-,泛醇的大规模产业化年产量,5000,吨，占世界市场,44%,5000L,生物反应器,交联固定化菌体在反应,O,O,OH,+,消旋化,DL-PL,O,O,OH,L-PL,OH,OH,COOH,D-PA,O,O,OH,D-PL,内酯化,D-,泛解酸内酯,水解酶,浙江,鑫富药业,酶,-,化学耦联不对称合成左旋帕罗醇,原料利用率提高：底物近,100%,转化为目标产物，原子经济性大幅提高。,节能减排效果明显：有机溶剂用量减少约,59.3%,、“三废”排放减少约,39.4%,。,产品质量提高：,ee,值大于,99.5%,（化学法,99.0%,）。,抗抑郁药帕罗西汀手性中间体左旋帕罗醇的合成,浙江,九洲药业,工程菌，酯酶；大孔树脂固定化酶；重复使用,20,次以上,（,Industrial Engineering Chemistry&Research(2010,2008a,2008b),酵母展示脂肪酶在生物合成中的应用,脂肪酶,CALB/RML,酰基供体,油，脂肪酸、己酸等,酰基受体,甲醇，乙醇，糖醇等,反应体系,非水相,/,离子液等,产物及性质,芳香酯，表面活性剂，生物柴油等,应用,酵母展示脂肪酶在短链芳香酯合成的应用,无水体系中不同酸醇摩尔比对合成己酸乙酯的影响,无溶剂体系下酶催化合成芳香酯,酯,酸醇摩尔比,6h,转化率,12h,转化率,24h,转化率,乙酸丁酯,乙酸异戊酯,乙酸叶醇酯,乙酸香叶酯,丁酸乙酯,丁酸异戊酯,丁酸叶醇酯,丁酸香叶酯,己酸乙酯,己酸丁酯,己酸己酯,己酸香叶酯,庚酸乙酯,辛酸乙酯,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,1,：,2,25.3%,22.0%,25.0%,9.5%,72.9%,70.1%,80.8%,19.0%,88.0%,56.3%,42.4%,18.8%,69.1%,24.1%,40.5%,40.1%,53.6%,38.1%,88.5%,90.4%,84.6%,76.9%,90.2%,88.9%,72.2%,60.2%,87.7%,55.0%,79.0%,85.9%,85.7%,85.7%,89.4%,92.3%,84.6%,90.5%,90.0%,90.6%,84.0%,90.6%,88.0%,87.9%,无水体系下合成芳香酯,酶传感器,酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。,最常用的酶传感器是,酶电极,，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。,酶电极,酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。,1962,年,Clark,和,Lyons,提出模型，,1967,年,Updike和,Hicks,首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。,酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、,H,2,O,2,电极等，后者有,NH,3,、,CO,2,、,H,2,电极等。,较典型的一种酶电极为,葡萄糖酶电极,。,葡萄糖醌,H,2,O,葡萄糖酸氢醌,葡萄糖氧化酶,氢醌 醌,2H,2e,Pt,铂电极,葡萄糖酶电极,葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（,GOD,），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖,(glucose),分析仪,脲电极,Urea+2H,2,O 2NH,4,+,+2HCO,3,-,脲酶,产生的,2NH,4,+,为阳离子电极感应。,此外还有：,氨基酸电极,醇电极,尿酸电极,乳酸电极,青霉素电极,亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生,NH,3,一些常见的酶电极,底 物,酶,电 极,5,腺苷酸,5,腺苷酸脱氨酶,NH,4,+,乙醇，醇,乙醇脱氢酶,Pt,过氧化物,过氧化氢酶,Pt(O,2,),磷酸葡萄,硫酸酯酶,+,葡萄糖氧化酶,Pt(O,2,),D-,氨基酸,D,氨基酸氧化酶,NH,4,+,L-,氨基酸,L,氨基酸氧化酶,NH,3,蔗糖,蔗糖酶,+,葡萄糖氧化酶,Pt(H,2,O,2,),琥珀酸,琥珀酸脱氢酶,Pt(O,2,),硫酸酯,芳基硫酸酯酶,Pt,硫氰酸,硫氰酸酶,CN,硝酸盐,硝酸盐还原酶,/,亚硝酸盐还原酶,NH,4,+,亚硝酸盐,亚硝酸盐还原酶,NH,3,（气体）,草酸,草酸脱羧酶,CO,2,（气体）,青霉素,青霉素酶,pH,乳酸,乳酸脱氢酶；细胞色素,b,Pt,，,Fe,（,CN,）,-4,L,氨基酸,脱羧酶,CO,2,L,精氨酸,精氨酸酶,NH,4,+,L,天冬酰胺,天冬酰胺酶,NH,4,+,本章,目录,