色谱条件的选择.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,色谱条件的选择讲稿,山东大学 王吉顺,2005.8,色谱条件包括以下内容：,1.仪 器：生产商，型号,2.,色谱柱：柱商品名称，填料商品名称，填料类型，,色谱 柱长度（,cm）,和内径（,mm），,填料粒经（,um）,3.,流动相：流动相组成和比例，流速（,ml/min）,4.,检测器：型号及参数（如波长,nm）,5.,进样量：体积（,ul,）,6.,柱 温：（,）,其中我们更为关心的是：色谱柱和流动相（本章节主要讨论的问题）,色谱柱的选择,大多数化合物是可以使用,C18,柱分离,C18,优点：柱便宜，流动相便宜，使用时间长，易于通过改变流动相得到最佳分离，,药品本身具有纯度高的特点，容易分离，辅料和分解产物是分离的难点。,比中药成分的分离，体液中药物成分的分离，微量成分的分离，杂质成分的分离，食品中药物残留的分离简单的多。,选择色谱条件的方法,1查文献，学习别人的方法,2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件,3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。,不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,色谱柱的分类,1,根据担体材料分类,（1）硅胶型：,SiO,2,；C,18,；C,1三甲基,；,C,2,；C,4,；C,8,；CN；NH,2,；,苯基,（2）聚合物型：聚苯乙烯类（离子交换；凝胶色谱柱）；,聚丙烯酸酯（离子交换）；,聚乙烯醇：,C,18,；,离子交换,（3）钛柱：比硅胶型的稳定性提高,（4）其它类型,色谱柱的分类,2.,根据分离方式分类,(1)正相：,SiO,2,；CN；NH,2,；,苯基,(2)反相：,C,18,；C,1,三甲基；,C,2,；C,4,；C,8,；CN；NH,2,；,苯基,(3)离子交换：弱碱阴离子交换；弱酸阳离子交换,强碱阴离子交换；强酸阳离子交换,(4)凝胶过滤：水溶性凝胶过滤；油溶性凝胶过滤,(5)其它类型：手性柱等,色谱柱的分类,3.根据色谱柱尺寸分类,（1）10,cm,50cm,内径为制备柱,（2）4,cm,8cm,内径为标准柱,（3）3,cm,一下内径为小孔柱或微孔柱和毛细管柱,（4）柱长一般为,15,cm,、,25cm,、,30cm,；,50cm,一般用于制备柱或特殊柱型，,5,cm,一下为快速柱,(,包括预柱和保护柱,),色谱柱选择方法,1.氨基酸,(1)结构特殊，一般使用离子交换柱分离，阳离子交换柱是使用最广泛,是最成熟的方法。分离氨基酸的阳离子柱分为锂型柱和钠型柱，锂型柱可以分离谷氨酰胺和谷氨酸。,(2)反相柱也可以分离氨基酸，但不能分离所有氨基酸。柱前衍生化法分离水解氨基酸也非常有效，且方法简便，所用的仪器简单。,氨基酸分析,分析条件：,色谱柱：,Shim-,pak,ISC-07/S1504Li（15cm 4.0mm）,（Li,型磺酸基，氨基酸分析专用柱）,流动相：柠檬酸缓冲溶液，梯度洗脱,流速：0.3,ml/min,柱温：55,检测器：荧光（,Ex.238nm,Em450nm）,方法：,OPA,柱后衍生化法,色谱柱选择方法,肽和蛋白质,凝胶过滤：根据分子量的大小差别进行分离,离子交换：根据分子所带的电荷的差别进行分离,反相和疏水色谱：根据分子的疏水性质的差别进行分离,亲和色谱：根据复合的相互作用的差别进行分离,蛋白质,分析条件：,色谱柱：,Shim-,pak Diol,300,（50cm 7.9mm）,（,二醇基水溶性凝胶柱，,蛋白质分析专用柱）,流动相：10,mM,磷酸缓冲液（,pH7,）,和0.1,MNaCl,流速：1.0,ml/min,柱温：室温,检测器：紫外（280,nm）,色谱峰：1.谷氨酸脱氢酶 2.乳酸脱氢酶,3.烯醇酶 4.腺苷酸激酶,5.细胞色素,C,蛋白质,分析条件：,色谱柱：,Shim-,pak Diol,300,（50cm 7.9mm）,（,消除残留硅醇基,C,2,柱，,300,A,多孔硅胶）,流动相：硫酸铵/磷酸缓冲液（,pH7,）,梯度洗脱,流速：0.5,ml/min,柱温：室温,检测器：紫外（220,nm）,色谱峰：1.细胞色素,C,2.肌红蛋白,3.核糖核酸酶,A 4.,铁,传递蛋白,5.糜蛋白酶原,A,色谱柱选择方法,核酸,核酸在生命科学领域中占有重要位置，在今后的新药研发领域中同样占有重要位置。核酸可以分为一下三类：,腺嘌呤（核酸碱基）腺苷（核苷；核酸碱基糖）腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）,腺嘌呤（核酸碱基）和腺苷（核苷；核酸碱基糖）用阳离子交换柱或反相柱进行分离；,腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）用阴离子交换柱分离，选择合适的流动相也可以用反相柱进行洗脱；,核酸,分析条件：,色谱柱：,Shim-,pak,WAX1,（5cm 4.0mm）,（,叔氨基阴离子交换柱，,用于分析核苷酸）,流动相：20,mM,磷酸缓冲液（,pH7,）,480,mM,磷酸缓冲液（,pH6.8,）,梯度洗脱,流速：1.0,ml/min,柱温：45,检测器：紫外（260,nm）,色谱峰：1.尿苷酸,2.胞苷酸,3.腺苷酸,4.,鸟苷酸,5.尿苷二磷酸 6.胞苷二磷酸,7.,腺苷二磷酸 8.尿苷三磷酸,9.鸟苷二磷酸 10.胞苷三磷酸,11.腺苷三磷酸 12.鸟苷三磷酸,核酸,分析条件：,色谱柱：,Shim-,pak,SBCC,8,（15cm 2.5mm）,（,小孔径硅胶键合,C,8,）,流动相：20,mM,磷酸二氢钾缓冲液/甲醇（93/7）,流速：0.5,ml/min,柱温：室温,检测器：紫外（260,nm）,色谱峰：1.胞苷,2.尿苷,3.鸟苷,4.,胸苷,5.腺苷,核酸,分析条件：,色谱柱：,ODS,柱,（15cm 6.0mm）,（,经甲烷基化处理的,ODS,柱）,流动相：100,mM,磷酸缓冲液和,200,mM,高氯酸钠溶液,梯度洗脱,流速：1.5,ml/min,柱温：50,检测器：紫外（260,nm）,色谱峰：1.未知峰,2.胞嘧啶,3.尿嘧啶,4.,鸟,嘌呤,5.腺嘌呤 6.胞苷,7.,尿苷 8.胸腺激素,9.腺苷 10.鸟苷,11.胸苷,色谱柱选择方法,糖的分离,糖的种类很多，可分为单糖（木糖，阿拉伯糖；葡萄糖，果糖，半乳糖）、二糖（蔗糖，麦芽糖）、低聚糖和多糖。,单糖和二糖可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用阴离子交换柱分离，缺点是分离时间较长。,低聚糖也可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离（色谱柱价格较贵，色谱柱不易保存）。,多糖使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离。,另外还用部分公司生产糖分析专用色谱柱。,糖的分离,分析条件：,色谱柱：,NH,2,柱,（15cm 6.0mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱）,流动相：乙腈/水（7/3）,流速：1.0,ml/min,柱温：室温,检测器：示差折光,色谱峰：1.丙三醇,2.木糖,3.果糖,4.,葡萄糖,5.蔗糖 6.麦芽糖,7.,乳糖,糖的分离,分析条件：,色谱柱：磺化聚苯乙烯,Ca,型柱,（30cm 7.9mm）,（,分离机理为凝胶渗透配位交换）,流动相：乙腈/水（7/3）,流速：1.0,ml/min,柱温：室温,检测器：示差折光,色谱峰：1.丙三醇,2.木糖,3.果糖,4.,葡萄糖,5.蔗糖 6.麦芽糖,7.,乳糖,色谱柱选择方法,维生素的分离,维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素,水溶性维生素：,维生素,B，,维生素,C，,维生素,H，,维生素,P，,泛酸等,脂溶性维生素：,维生素,A，,维生素,D，,维生素,E，,维生素,K,分离方式：,和脂溶性维生素均可使用反相洗脱法分离。,一些脂溶性维生素可以使用分配色谱法分离,维生素,C,的分离,分析条件：,色谱柱：,NH,2,柱,（15cm 6.0mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱，分配色谱）,流动相：乙腈/10,mM,磷酸缓冲液（,pH2.6）（3/1）,流速：1.5,ml/min,柱温：40,检测器：紫外（245,nm）,色谱峰：1.异抗坏血酸,2.抗坏血酸,维生素,E,的分离,分析条件：,色谱柱：,SiO,2,柱,（5cm 4.6mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱，分配色谱）,流动相：正己烷/二恶烷/乙醇,（98/2/0.2）,流速：2.5,ml/min,柱温：室温,检测器：紫外（295,nm）,色谱峰：,维生素,E,的分离,分析条件：,色谱柱：,NH,2,柱,（15cm 6.0mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱，分配色谱）,流动相：正己烷/异丙醇,（25/1）,流速：1.5,ml/min,柱温：40,检测器：紫外（297,nm）,色谱峰：,维生素,B,族的分离,分析条件：,色谱柱：,ODS,柱,（15cm 6.0mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱，分配色谱）,流动相：【100,mM,硫酸钠（,pH2.1）,和1.2,mM,辛烷磺酸钠】/乙腈,（9/1）,流速：1.2,ml/min,柱温：40,检测器：紫外（210,nm）,色谱峰：1.烟酸,2.烟酰胺,3.泛酸,4.,磷酸核黄素,5.吡哆素 6.咖啡因,7.,硫胺素 8.核黄素,色谱柱选择方法,阴阳离子分离,阴离子可以使用离子交换柱分离，也可以使用,C,18,分离（离子对色谱法）。离子交换法分离二价阳离子,分析条件：,色谱柱：磺化聚苯乙烯磺酸基离子交换柱,（15cm 5.0mm）,（,离子交换色谱）,流动相：0.3,M,乳酸水溶液,流速：1.0,ml/min,柱温：40,检测器：电导,色谱峰：,离子对色谱法分离阴离子,分析条件：,色谱柱：,ODS,柱,（15cm 6.0mm）,（,硅胶键合,NH,2,柱，分配色谱）,流动相：0.8,mM,苯三酸和10,mM,四丁基氢氧化铵（,pH4.6）,流速：1.5,ml/min,柱温：40,检测器：紫外（282,nm）,色谱峰：,色谱柱选择方法,非极性化合物和弱极性化合物,一般使用,ODS,均可分离。,被测样品在流动相中微溶，如果溶解度大则出峰较快，不溶则不出峰。,芳烃一般作为,ODS,柱的柱效测试样品，以甲醇水作流动相便可得到对称峰型，否则色谱柱有问题。,如果非极性化合物和弱极性化合物在,ODS,上拖尾，四氢呋喃是很好的减尾剂。,带有氨基的有机化合物是检验,ODS,柱是否封端的指示剂（如尿嘧啶）。,色谱柱柱效测定方法,分析条件：,色谱柱：,ODS,柱,（15cm 6.0mm）,流动相：甲醇/水,（3/1）,流速：1.0,ml/min,柱温：40,检测器：紫外（254,nm）,色谱峰：1.尿嘧啶,2.苯,3.萘,4.,联苯,色谱柱选择方法总结,1查文献，学习别人的方法,2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件,3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。,不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,