实验——DNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,DNA,分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接,实验原理,限制性内切酶（,restriction endonuclease,）是一类能识别双链,DNA,分子中特定碱基序列的核酸水解酶，简称限制酶或内切酶。,E,coR I,酶,识别,：,5N-GA-A-T-T-C-N-,-N-C-T-T-A-AG-N-5,Bam H,I,酶,识别：,5N-GG-A-T-C-C-N-,-,N-C-C-T-A-GG-N-5,实验原理,限制性核酸内切酶的命名,：,以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系E,coR,：来自,Escherichia coli,RY13,B,amH,：来自,Bacillus amylolique faciens,H,（淀粉液化芽孢杆菌）,在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号。,实验原理,两种不同的,限制性核酸内切酶,同时切割同一底物时，要采用两种酶都适合的缓冲液。,本实验所用的,10,K,缓冲液,，成分如下：,200 mM Tris-HCl,，,pH8.5,100 mM MgCl2,10 mM DTT,（二硫苏糖醇）,1000 mM KCl,实验原理,操作步骤,双酶切反应：在离心管内，按顺序加入下列成分（单位：,L,）底物,DNA 24,10,K,缓冲液,3,E,coR I,酶,1.5,B,amH I,酶,1.5,总体积,30,把离心管放入,37,水浴中酶切,2,小时,后，,85,水浴,5 min,终止酶切反应。,操作步骤,酶切产物的纯化：,往反应体系中各加入,60,L,的,0,无水乙醇，混合后冰浴,2,分钟。,12000 rpm,离心,5 min,。,用,200,L 70%,乙醇洗涤双链,DNA,沉淀，,12000 rpm,离心,2 min,。,去掉上清，用热风吹干。,以,10,l,无菌双蒸水溶解沉淀。,连接反应：在,PCR,管内，按照顺序加入下列成分（单位：,L,）：,pUC19,双酶切产物,1.5,PCR,产物双酶切产物,6.5,10,T4,缓冲液,1,T4,连接酶,1,总体积,10,注意事项,每,吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。,加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰,浴,。,往反应体系中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复吹吸以使溶液混合。,纯化,DNA,片段时，小心倾倒上清液，不要把,DNA,倒掉。,若反应体系管壁上挂液，必须高速离心使反应液集中。,思考题,限制性内切酶切割实验中，酶切的时间过长或过短有对酶切效果有何影响？,影响连接酶作用效果的因素主要有哪些？,下次实验,重组,DNA,转化宿主细胞,