分子实验技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学技术,1,第一节、重组,DNA,技术,-,基因工程,第二节、分子杂交及相关技术,第三节、聚合酶链反应的原理和应用,第四节、基因定位的常用方法,2,分子生物学技术,70,年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律,。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。,下面就一些分子生物学技术予以介绍,。,3,1946 1950 1955 1960 1965,1970 1975 1980 1985 1990 1995,1944DNA,是遗传物质,1949Hbs,贫血,1953,双螺旋,1956HbsGlu-Val,1966,遗传密码,第一个,R,酶,1972,重组,质粒,1975DNA,杂交,1977DNA,测序,1981,转,G,小鼠,1983HD,病,G,定位,1985PCR,1986,位置克隆,1987G,剔除小鼠,1989,位置克隆,1990,第一个基因治疗,1995,细菌,G,组序列,1996,酵母基因组序列,现代分子遗传学发展,重要事件,4,第一节 重组,DNA,技术,-,基因工程,重组,DNA,技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程,(Gene Engineering),的核心技术。,重组,DNA,技术（,Recombinant DNA Technique,）,是人类根据需要选择目的基因（,DNA,片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。,这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,5,一、,限制酶,限制性内切核酸酶,(restrictive,endonucleases,),，,又称限制酶。是特异性地切断,DNA,链中磷酸二酯键的核酸酶（,“,分子手术刀,”,）。,发现于原核生物体内，现已分离出,100,多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组,DNA,技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,6,1限制酶的命名,根据其来源命名。如：,属名,菌株名,E,co,R I,种名,编号,EcoRI,来源于大肠杆菌,E.coli,的,RY13,菌株,I,指在该菌株中分离的第一个限制酶。,7,2,、限制酶识别序列和切割形成,每种限制酶能识别和切割的通常,4,8,个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。,如：,Hare 5-GGCC-3,Bam HI 5-GGATCC-3,平末端,(blunt end),对称轴切，连接效果差,切割形成,粘性末端（,sticky end,）,交错切。,8,9,部分常用限制酶及切点,10,互补末端连接,11,产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：,1),用同一种限制酶切割；,2),用识别相同靶序列的不同限制酶切割；,3),用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,12,3,、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：,1),不论,DNA,的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的,DNA,重组。如人和质粒,DNA,等。,2),用于人类基因组的,DNA,分析，具特定的酶切位点。,3)Gene,突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,13,二、基因运载体及其选择,载体（,Vector,）,:,将外源目的,DNA,导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。14,载体具以下特征,：,1),分子量小，便于携带较大的,DNA,片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；,2),有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；,3),被切割后的载体，插入外源,DNA,后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。,常用的载体有,：质粒，,噬菌体，粘粒，,BAC,，,YAC,，,PI,等。,15,（一）,.,质粒,plasmid,Plasmid,独立于细菌染色体外的双链环,DNA,分子。,PBR322,大肠杆菌,pSC101,Plasmid chromosome,COIEI,plasmid,革兰氏阴性菌,pc194,scp12,真核生物,-,酵母质粒16,常用的质粒如,pUC19,，,多连接子,MCS,。,插入外源基因片段长度约,10kb,。,将外源基因插入到,MCS,中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到,MCS,后，,-,半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色,-,白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori,复制起点,LacZ,AP,R,pUC19,17,（二）,.,-,噬菌体,(,phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌,.,-,噬菌体,DNA,是线状双链,DNA,分子,全长约,50kb,每条链各带,12bp,长的单链互补末端,-,粘末端,(COS,序列,),。进入宿主细胞后不久，,COS,序列碱基配对环化。,改建后的,噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,18,1,、,置换,载体,溶解途径,载体和外源,DNA,整合到宿主菌,DNA,中。可克隆,23kb,的外源,DNA,。,2,、,插入,载体,裂解途径,DNA,在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆,5kb,的,cDNA,。,19,裂解途径,20,（,三）,.,粘粒,(,cosmid,vector),（,30,40kb,）,是将质粒和,噬菌体改建的一种载体,.,它含,COS,序列,插入一小,plasmid,而得名,Cosmid,。,改建后的粘粒含有,噬菌体的复制起点和,cos,末端。全长,8kb,。,大片段外源,DNA,插入后，在体外包装进而被克隆。可包装,30,45kb,长的,DNA,片段，多用于基因文库构建。,21,(,四,),大片段,DNA,克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：,DMD gene 2300kb,），,克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：,BAC,，,PI,，,YAC,等。,22,1,、细菌人工染色体（,bacterial artificial chromosome,BAC,）,优点：能携带大片段,DNA,，约,300kb,。,在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产,DNA缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆,DNA,部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，,E coli,中的,F,因子。此质粒含有,2,种基因（,part A,part B,）。,每个,E coli,能接受,300kbDNA,片段。,23,2,、噬菌体,PI,载体和,PAC,PI,噬菌体与,噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（,110,115kb,）,线性,DNA,，,并在体外包装于,PI,壳内。,PI,进入宿主细胞后环化，扩增。,1994,年，有人将,PI,和,F,因子克隆结合产生,PI,人工染色体克隆系统,-PAC,。,24,3,、酵母人工染色体yeast artificial chromosome,YAC,）,适用于克隆大片段,DNA,，,0.2,2Mb,。,25,YAC,的主要功能成份有三：,1,）,着丝粒,：,mitosis,姊妹染色单体和,减,I,同源染色体分离之必需,。,2,）,端粒：,保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。,3,）,自主复制序列（,ARS,）,元件,：是染色体自主复制的复制起点。,构建,YAC,需要,4,个短序列：,2,个端粒，着丝粒，,ARS,元件，与外源,DNA,连接成线性,DNA,分子，导入酵母细胞克隆。,26,三、,DNA,重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA,重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的,DNA,片段，,称为,DNA,克隆，亦称分子克隆。,27,基本原理与过程：,1,、分离纯化目的基因,2,、目的基因,+vector=,重组,DNA,分子,3,、重组,DNA,分子导入受体细胞，并在其内增殖。,4,、筛选含有重组,DNA,的细胞,细胞克隆（,cell clone,），,将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。,5,、分离重组,DNA,克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重,组,DNA,。,28,分离纯化目的基因目的基因,+vector=,重组,DNA,分子,29,重组,DNA,和,分子,克隆,30,重组,DNA,和分子克隆的几种方法：,（,依目的基因的来源,）,1,、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,2,、由特定,mRNA,逆转录合成,cDNA,后再进行,克隆,3,、化学合成目的基因进行克隆,4,、,PCR,体外扩增目的片段进行克隆,31,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,32,筛选含有重组,DNA,的细胞,细胞克隆（,cell clone,）,33,筛查含有目的基因的细胞克隆,34,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。,重组DNA,技术的另一目的是获得基因重组后的产物,RNA,，,蛋白质。,就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（,expression cloning,）,.,35,目的基因表达,36,（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，,RNA,剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆,菌为宿主。,真核多肽的表达要求：,1,）适当的,cDNA,（,完整的编码序列）；,2,）适当的表达载体，提供特定多肽信息；,3,）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。,产物特征：,1,）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；,2,）活性受限或无活性。,37,(,二,),、真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。,应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。,产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,38,五,、基因文库,基因文库,（,gene library,）,应用,DNA,重组技术构建的含有基因组的全部基因的,DNA,克隆。,39,（,一）,构建基因,组,DNA,文库,40,（,二）染色体特异的基因文库 （,chromosome specific library,）,单个染色体,细胞克隆,（流式,C,仪）,细胞,染色体,染色体文库,染色体区带,区带特异,（显微切割）,DNA,文库,41,（三）,cDNA,文库（,cDNA,library,）,cDNA,文库构建：,特定组织细胞一定发育阶段,总,mRNA,42,