分子生物学检验技术第3章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第,三,章,蛋白质组与蛋白质组学,中南大学 罗建新,第,三,章,蛋白质组与蛋白质组学,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,第,三,章,蛋白质组与蛋白质组学,第,一,节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节 蛋白质组及其质点的分离与分析,第三节 蛋白质相互作用的研究,第四节 蛋白质数据库及其应用,第,一,节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,第,一,节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,蛋白质组,prote,in+gen,ome,proteome,一种基因组所表达的全部蛋白质,一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,蛋白质组学,阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式,从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,一、,蛋白质组与蛋白质组学的定义,第,二,节 蛋白质组及其质点的分离与分析,一、分离纯化,第,二,节 蛋白质组及其质点的分离与分析,二、,分析,鉴定,一、分 离 纯 化,（二）破碎细胞,（三）蛋白质混合物的分离方法,（四）蛋白质分离纯化的条件,（一）选择材料,目的蛋白质的含量,提取蛋白质的材料,一、分 离 纯 化,（一）选择材料,一、分 离 纯 化,（二）破碎细胞,机械法,物理法,化学法,根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行：,1.,根据溶解度,2.,根据分子量,透析和超滤,平衡离心,凝胶过滤层析,（三）蛋白质混合物的分离方法,一、分 离 纯 化,3.,根据电荷,毛细管电泳,离子交换层析,4.,根据蛋白质的亲和能力,亲和层析,一、分 离 纯 化,（四）蛋白质分离纯化的条件,缓冲液,盐、金属离子和螯合剂,还原剂,去垢剂,蛋白酶抑制剂,表面效应,蛋白质的环境因素 温度,储存一、分 离 纯 化,二、分析鉴定,（三）图像分析技术,（四）放射性核素标记亲和标签法,（五）蛋白质芯片技术,（六）质谱技术,（一）,Western,印迹技术,（二）二维凝胶电泳（,2-DE,）技术,（七）其它方法,二、分析鉴定,（一）,Western,印迹技术,基本操作步骤：,蛋白样品的制备,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的电转移,蛋白质与抗体的结合反应,目标蛋白质的显示,western,印迹基本步骤图示,（二）二维凝胶电泳（,2-DE),技术,目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一,由两相组成：,第一相：等电聚焦凝胶电泳,(,根据蛋白质电荷差异,),第二相：,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,根据蛋白质分子量差异,),二、分析鉴定,二、分析鉴定,2-DE,技术原理,2-DE,分析的基本步骤,蛋白质,溶解,变性,还原,去除蛋白,质杂志,利用不同,pK,固定化,电解质配,置不同,pH,范围的凝,胶,利用软件,设计配置,第一相电泳,(IPG,IFE),平衡,第二相电泳,(SDS,PAGE),考马斯亮,蓝染色,银染色,铜染色,样品制备,IPG,胶制备,双相电泳,染色,二、分析鉴定,2-DE,获得的蛋白质图谱,二、分析鉴定,通过,2-DE,得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。,(,三,),图像分析技术,二、分析鉴定,2-DE,图像分析软件包操作过程：,图像采集,斑点检测,背景消减,获得蛋白质相关信息,图像内及图像间的比较,二、分析鉴定,（四）放射性核素标记亲和标签法,正常细胞,D0,亲和标签,病理细胞,D8,亲和标签,混合并消化,生物素亲和纯化,液相色谱质谱联用分析,测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度,二、分析鉴定,（五）蛋白质芯片技术,二、分析鉴定,原理,样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（,m/e,）,的差异确定分子量。,应用,蛋白质的序列分析,研究蛋白质的修饰,（六）质谱技术,二、分析鉴定,（七）其它方法,Edman,降解法测定蛋白质多肽的排列顺序,核磁共振（,NMR,）,、,荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构,X,射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等,二、分析鉴定,第三节蛋白质相互作用的研究,第三节,蛋白质相互作用的研究,二、蛋白质核酸,一、蛋白质蛋白质,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,（三）蛋白质相互作用的研究方法,（一）蛋白质,-,蛋白质相互作用的形式,（一）蛋白质,-,蛋白质相互作用的形式,1.,蛋白质亚基的聚合,2.,交叉聚合,3.,分子识别,4.,分子的自我装配,5.,多酶复合体,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,氢键,范德华力,疏水键,离子键,一、蛋白质蛋白质,一、蛋白质蛋白质,（三）蛋白质相互作用的研究方法,1.,酵母双杂交系统,2.,噬菌体展示,3.,生物传感芯片质谱,4.,定点诱变技术,蛋白质亲和层析,亲和印迹,免疫沉淀,交联,酵母双杂交,噬菌体展示,生物传感芯片质谱,蛋白质工程中的定点诱变技术,一、蛋白质蛋白质,研究方法,传统技术,新技术,1.,酵母双杂交系统,DNA-BD,具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，,DNA-AD,则具有活化转录的功能。,报告基因,一、蛋白质蛋白质,DNA-BD,和,DNA-AD,分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。,只有当蛋白质,X,与蛋白质,Y,间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能一、蛋白质蛋白质,二、蛋白质,-,核酸,（二）滤膜结合,（三）甲基化干扰,（四）,DNase,足纹,（五）核酸,-,蛋白质杂交,（一）凝胶滞后试验,二、蛋白质,-,核酸,（,一）凝胶滞后试验,蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，所形成的复合物电泳时在凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合的游离探针慢，即表现为相对滞后,该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性,（二）滤膜结合法,利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链,DNA,，,但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的,DNA,片段与游离,DNA,片段分离开。,二、蛋白质,-,核酸,（三）甲基化干扰,经甲基化修饰的,DNA,探针可以干扰蛋白质的结合。将,DNA,甲基化后与蛋白质进行反应，只有在结合位点上未被修饰的,DNA,片段才能与蛋白质结合。,DNA,探针的末端标记,及探针的甲基化,蛋白质与甲基化探针的结合及,DNA,蛋白质结合探针的分离,结合物及对照探针,的化学切割,DNA,片段的序列测定,二、蛋白质,-,核酸,二、蛋白质,-,核酸,用特殊方法将,DNA,从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白质的,DNA,可在随机修饰的位点被切割，而结合蛋白质的,DNA,在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。,（三）甲基化干扰,（四）,DNase,足纹,目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法,原理：,DNase,可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将,DNA,切成单核苷酸，而结合有蛋白质的,DNA,免于,DNase,的水解。,二、蛋白质,-,核酸,DNase,足纹分析原理示意图,（五）核酸,-,蛋白质杂交实验,TBE,缓冲液中,DNA,蛋白质杂交,放射自显影,用于鉴定蛋白质与,DNA,的特异性结合和确定结合蛋白质的分子量。,基本步骤：,蛋白质杂交,SDS-PAGE,转移至,NC,膜或,Nylon,膜,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的,DNA,片段作探针,多次洗膜,二、蛋白质,-,核酸,第四节 蛋白质数据库及其应用,第四节 蛋白质数据库及其应用,二、蛋白质数据库的应用,一、蛋白质数据库,Protein Database),一、蛋白质数据库,（一）蛋白质序列数据库,（二）蛋白质结构数据库,（三）蛋白质直系同源簇数据库,（四）,DIP,数据库,一、蛋白质数据库,（,一）蛋白质序列数据库,SWISS-PROT,数据库：,,www.ebi.ac.uk/swissprot,PIR,和,PSD,数据库,,pir.georgetown.edu,/,ftp:/,nbrfa.georgetown.edu/pir,蛋白质数据库,,www.rcsb.org/pdb,/,蛋白质结构分类数据库,scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop,/,PROSITE,数据库,,www.expasy.ch/proside,/,（二）蛋白质结构数据库,一、蛋白质数据库,（三）蛋白质直系同源簇（,COGs,),数据库,,www.ncbi.nlm.nih.gov,/COG,（,四）,DIP,数据库,(DIP Database),dip.doe-mbi.ucla.edu,/,一、蛋白质数据库,二、蛋白质数据库的应用,（一）序列比较,序列两两对比,多序列对比,（二）临床诊断,（三）肿瘤治疗药物的开发,