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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Techniques in receptor research,尹长城,北京大学医学部生物物理学系,参考资料,参考书,受体研究技术,贺师鹏 胡雅儿 夏宗勤 主编,北京大学医学出版社 2004,实验室网页,受体概论,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,100,多年前，,J.N.Langley,发现箭毒能明显对抗烟碱的收缩效应,指出药物可能和细胞中某种特异成分结合而发挥作用，当箭毒与这种接受物质结合就阻断了烟碱的作用,他称这种特异成分为接受物质,(,receptive substance),1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,P.Ehrlich,认为细胞上有许多侧链，当细胞上的侧链基团和毒素分子的基团结构上互补形成类似钥匙和锁的关系，两个基团可相互结合,P.Ehrlich,将,细胞上的这些侧链称之为受体,(,receptor),根据受体理论，研究不同类型化学物质对锥虫的作用，提出了化学受体,(,chemoreceptor,),的概念,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,20,世纪,20,年代末，,A.J.Clark,提出了“占领理论”(,occupancy theory),生物活性通过“占领”受体结合位点而起作用，生物活性物质与其特异性受体之间的反应是一个可逆的处于动态平衡的过程，符合质量作用定律,提出了生物活性物质与相应受体亲和力的概念,提出了药物产生的效应与受体的结合量呈正比关系的概念,缺陷：不能解释不同药物作用于同一类受体会诱发不同的反应,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,1954,年，,E.J.,Ariens,提出内在活性,(,intrinsic activity),的概念,活性物质所产生的最大效应取决于分子本身的性质,完全激动剂,部分激动剂,完全拮抗剂,1956,年，,R.P.Stephenson,提出药物效能(,efficacy,),的概念,一种物质与受体结合所产生的效应取决于该物质的效能而不取决于占领受体的量,1961,年，,W.D.M.,Paton,提出速率理论(,rate theory),配基与受体相互作用，所引起的效应与其占领受体的速率成正比,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,直到20世纪60年代前受体还基本上是一个理论上的概念,受体是什么物质？,位于细胞的什么部位？,如何发挥作用？,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,20世纪60年代，受体研究进入新的阶段,首先，放射性同位素技术开始用于受体的研究，建立了放射性配基结合分析法,(,radioligand,binding assay，RBA),使人们能够在实际上接触到受体分子，为受体亲和力与受体数量的定量研究提供了可靠和灵敏的方法,可以对受体分子进行纯化，从而了解到受体分子都是有特定结构的蛋白质分子；为从分子水平上研究配基与受体的相互作用打下了基础,RBA,的出现大大推进了受体的研究，具有划时代的意义,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,其次，,20,世纪,70,年代,Sutherland,发现环核苷酸,(,cAMP,或,cGMP,),在激素与细胞反应的效应之间充当信使作用，从而提出第二信使学说,阐明了神经递质和激素作用于受体，引发信号转导机制并引起细胞功能的变化,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,第三，分子生物学技术推动了受体研究,通过,DNA,分子克隆技术阐明受体蛋白质的一级结构,通过基因同源性的研究找到很多过去用其它方法难于发现的受体或受体的新亚型,为研究受体结构和功能的关系提供了必不可少的前提,1.1 受体概念的形成与发展,1.1.1 受体概念的发展历史,第四，结构生物学的发展推动了受体研究,通过结构生物学获得受体蛋白的三维结构信息,阐明受体-配体相互作用的本质,阐明受体疾病的分子机理,辅助受体药物的设计,1.1.2 受体的现代概念,受体是存在于细胞表面或细胞内的，具有特异识别和结合细胞内外某些特定化学信号物质的蛋白质分子,化学信号物质,(,通常也称配基,),可以是激素、神经递质、细胞因子和生长因子、某些药物等,配基与受体结合，使受体激活并产生信号转导，启动细胞内相应的生物效应,受体研究的内容不仅仅限于受体与配基的相互作用，而且还包括受体的激活机制，受体激活后如何启动后续信号转导机制，信号转导的具体途径，以及如何引起相应的生物学效应等等,1.2,受体与配基结合反应的基本特性,1.,饱和性,对某种特定的细胞来说，每种特定的受体，其数量有一定限度,因此，配基与受体结合的反应具有饱和性,当配基浓度逐步增加，它和受体的特异结合也会逐步增加，但是当升高到一定浓度，会使绝大多数受体都被配基结合，再增加浓度，复合物的升高就很有限，表现出受体被饱和的现象。,特异的受体结合反应其受体呈高亲和性和低容量，非特异结合则呈低亲和性和高容量,1.2,受体与配基结合反应的基本特性,2.,可逆性,内源性配基和特异受体的结合反应属于可逆反应,当周围的配基浓度降低时，形成的复合物就会解离，重新变成游离的配基和受体,这种可逆性是受体对周围环境变化快速和正确反应的基础,外源性配基则有两类不同的情况,很多外源性配基和受体的结合也是可逆反应，解离后的配基是原形,另有一类不可逆阻断剂与受体形成的复合物是不可逆的，最终导致受体分子的破坏和配基的代谢变化,1.2,受体与配基结合反应的基本特性,3.特异性,受体具有特异识别配基的性能，,特定的受体只识别特定的配基,受体识别配基的基础是受体某个部位的立体结构，,即,受体蛋白的构象,各种受体的识别能力是不同的，受体识别能力强，受体特异性就好,受体的识别还和配基的构型和构象有关,只有存在严格构型和构象的配基分子才能选择性地与其受体结合,受体的特异性还表现在器官或组织的专一性（称靶器官），如子宫、阴道、乳腺等器官对雌激素敏感，因为这些器官上雌激素体受体的数量明显高于非靶器官,1.2,受体与配基结合反应的基本特性,受体的亲和力,受体和配基的结合能力，受体亲和力高说明受体和配基容易结合而不容易解离,受体亲和力的定量指标是受体的解离平衡常数,K,d,(,亲和常数,K,a,的倒数,),，,K,d,越大则亲和力越小,受体的,K,d,值一般在,108,-10,-12,mol,L,之间。,K,d,值小于,10,-9,mol/L,的通常称为高亲和力,受体的亲和力和配基种类有关，评价,K,d,值的绝对值大小必须指明配基的种类,1.2,受体与配基结合反应的基本特性,4.生物效应的相关性,受体的主要功能是介导配基的生物学效应，如果一种蛋白能与某种物质相结合而并不介导特定的生物学效应，那么这种蛋白不能称之为受体,生物效应和受体结合反应需有两方面的匹配:一是浓度上的匹配，二是组织分布的匹配,如果某种化合物与某种受体有结合，但该化合物的结合浓度明显不同于它引起生物效应的浓度，或者它引起生物效应的组织和它结合的组织不一致，那么这种化合物和受体的结合是否属于特异结合就有疑问,1.3,受体与配基相互作用,1.3.1,受体和配基的相互作用力和结合能,受体与配基的相互作用的本质为物理化学过程,作用力源自于带电荷基团间的静电作用或者非极性分子间的吸引作用,配基与受体的相互作用既然是一种物理化学过程，必然有成键过程，一定有能量释放,1.3,受体与配基相互作用,根据,Hammett,方程,R,是气体常数,T,是绝对温度,K,a,是结合平衡常数,G,是成键时释放的自由能，其值与,K,a,的对数,成正比，所以,K,a,值是评估成键作用能力的物理量,是受体和配基的结合能力的物理量,化学键类型与自由能的关系,化学键类型,G,(,KJmol,-1,),共价键,-170420),离子键,-(2142),偶极键,-(429),氢键,-(429),疏水键,-4,范特华力,-(24),1.3,受体与配基相互作用,实验证据表明，配体与受体相互作用是可逆反应,它们之间的作用力是属于较弱的次级键,静电作用,氢键,范德华力,疏水键等,1.3,受体与配基相互作用,1.静电作用,静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的静电吸引力,静电作用包括离子键、离子-偶极相互作用和偶极-偶极相互作用等三个方面,受体蛋白质的表面都有可电离的基团和偶极基团，受体蛋白质的活性中心大都有极性区域，易与含极性基团的配基生成离子键和其他静电作用,就药物而言，它和受体的最初作用通常是由于受体的活性中心极性基团对它的吸引所引起。许多药理效应的关键作用步骤要求通过电荷中心的作用来实现,离子键,在生理条件下，一些氨基酸如精氨酸、赖氨酸可以形成正离子,含有这些氨基酸的蛋白质受体在体内就可形成阳离子,可以与电性相反的配基或药物分子以离子键形式相结合,这种离子键可以解离，因此离子间的吸引力是可逆结合,离子键,作用力大小可用库仑定律表示,式中,q,1,、,q,2,为离子的电量，,r,为两个离子间的距离，,为介质的介电常数，,r,0,为单位矢量,相互作用能为,离子偶极相互作用,配基或药物分子和受体分子中,O,、,S,、,N,或,C,原子的电负性均不相等,这些原子形成的键由于电负性的差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与持久电荷可以形成静电作用,离子偶极相互作用,相互作用能由下式表示,式中,为偶极矩，,为偶极方向与电荷至偶极中心连线的夹角，,q,为电荷电量，,为介电常数，,r,为电荷与偶极中心的距离。,离子偶极相互作用比离子键小得多，键能与距离的平方成反比。由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响药物受体的作用强度，随方向的变化而变化。,偶极偶极相互作用,两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极,两个偶极间的作用能由下式表示,式中,x,为偶极矩，,为介电常数，,r,为偶极中心的距离,偶极偶极相互作用,偶极偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置,偶极偶极相互作用非常普遍，常发生在水溶液中。水分子是偶极分子，它可与带有羰基或杂原子的药物作用,药物也可与蛋白质受体等生物大分子的极性基团作用,偶极,-,偶极作用对配基受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要,2.氢键,氢键的形成,:,氢键是由两个负电性原子,(,N,O,S,等,),对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊的偶极-偶极键,它是质子给予体,X-H,和质子接受体,Y,之间一种特殊类型的相互作用，是,H,原子和电负性很强的杂原子之间作用的键，即,X-H,YR,在氢键中，最常见的质子给予体有,OH,、,NH,，,而,SH,是很弱的质子给予体。质子接受体均有未成键的,p,电子或,电子，通常有,OH,、,OR,、,NH,2,、,N,（,芳香氮）、,NH-R,、,卤素、,SR,、,C=C,、,C=N,等,氢键,在生物体系中，基本溶剂水以及蛋白质、核酸等都含有大量能形成氢键的基团,药物进入生物体系以及构成特殊状态与受体分子间相互作用的过程中，氢键对分子的取向有非常重要的作用,最常见的氢键在羟基和胺基之间形成,生物体系中超分子的自组装离不开氢键的参与，如,DNA,分子中的,A:T,及,G:C,残基间的氢键作用,氢键,氢键的大小及方向,:,氢键的大小通常由氢键的键能来描述，它是指发生下列过程所需要的能量,X-H,YRX-H+Y-R,氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中通常为8.433.4,kJ/mol,(,28kcal/mol,)。,键长为,0.250.32,nm,氢键,氢键的方向用键角来表示，是指,X-H,与,H,Y,之间的夹角，一般为,180,125,最强的氢键是,X,、,H,、,Y,均在一条直线上，即键角为,180,非直线型氢键比直线型弱，一般只有,8.4,kJ/mol（2kcal/mol,）,左右，比水分子氢键的特征值,20.9,kJ/mol(5kcal/mol),弱得多，但许多这样的弱作用的合力是很大的，对稳定生物大分子的高级结构起重要作用,氢键的分类,按氢键强弱进行分类。这种方法依据谱波学和晶体结构数据进行分类,分类,OH,(cm,-1,),r,(O,H),(nm),实例,弱氢键,3200,0.270,H,2,O,(,冰、水合物,）,R-OH,(,醇、酚,),中强氢键,28003100,0.2600.270,R-COOH,(,羧酸,),强氢键,7002700,0.2400.260,MH(RCOO),2,(,酸盐,),氢键的分类,两种特殊形式的氢键:,对称氢键，即氢键质子位于给体和受体原子间连线的中点，已知的实例有,KHF2,和二甲酸氢钠等,分叉氢键（或称多中心氢键），即一个质子给体,X-H,可与两个或三个受体,Y,形成氢键。在一些生物小分子水合物晶体中，分叉氢键比普通氢键出现的机会更多一些,3.范德华力,范德华力是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力,范德华力是一种比较弱的、非特异性的作用力,范德华力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约,0.40.6,nm,（,4-6,）,时，这种力表现出较大的集合性质,范德华力包括引力和斥力，涉及四种作用力,静电力,诱导力,色散力,排斥力,范德华力,按照量子力学的微扰方法所得到的能量分解，可将范德华力的能量表示为：,E=E,引,+,E,斥,=,E,静,+,E,诱,+,E,色,+,E,斥,式中,E,静,、,E,诱,、,E,色,、,E,斥,分别是静电力、诱导力、色散力、斥力所表示的能量。,范德华力,诱导力,:,永久偶极矩将诱导邻近分子使发生电荷位移，出现诱导偶极矩。永久偶极矩和诱导偶极矩之间存在吸收作用，此相互作用的能量称为诱导能,偶极矩为,1,的分子,1,与极化率为,2,的分子,2,之间的平均诱导能为：,诱导力通常是较弱的，并且随温度升高而降低，这种作用力的大小随偶极矩指向的不同而不同，是有方向性的,范德华力,色散力,:,非极性分子有瞬间偶极矩。瞬间偶极矩将在邻近分子中诱导出新的偶极矩。瞬间偶极矩与诱导偶极矩间的相互作用力就叫色散力，该相互作用的能量叫色散能,London,推出两个分子之间色散能的近似表达式为,：,式中,I,1,I,2,为两个相互作用分子的电离能,1,2,分别为两个分子的极化率,范德华力,在非极性分子之间只有色散力；在极性分子和非极性分子之间有诱导力，也有色散力；在极性分子之间，静电力、诱导力和色散力都存在,这些作用力不仅存在于不同的分子间，而且还存在于一分子内的不同原子和基团之间,实验表明一般分子之间的这三种作用力，除个别极性很强的分子外，诱导力和静电力一般较小，色散力是主要的,色散力由分子的极化率,决定，它反映分子中电子云是否容易变形，当分子中电子数目增加，原子变大，外层电子离核较远，,增加，色散力增加；分子中有,键，其电子云也较,键容易变形，若有离域,键，则,一般都比较大，色散力增加，分子间作用力增强,范德华力,排斥力,:,当分子间相距较远时，表现为范德华引力；当分子靠得很近时，则会出现斥力。和吸引力相比排斥力是短程力，其作用能可近似表达为：,式中，,A,是个正值参数、,n,为,912,的数值,范德华力,分子间相互作用的范德华力的总的势能可表示为：,A,和,B,为常数，,可通过实验测定,范德华力,Lennard,-Jones,认为多数物质,n=12,时符合较好，这样分子间作用能可用,Lennard,-Jones 6-12,关系式表达：,根据该公式作,E-r,曲线时，曲线会出现最低点，相应这点的距离为平衡距离，此时体系的能量最低，分子间保持一定的接触距离。相邻分子相互接触的原子间的距离即为该两原子的范德华半径和,范德华半径比共价半径大，其变动范围也大。现在应用最广泛的范德华半径是由,Pauling,所给定的数值，而数据最全而又被一些人认为是最合适的范德华半径是由,Bondi,所给定的数值。,范德华力,范德华力是瞬息间作用力，时间大约为,10,-8,s,，,范德华引力与原子间距离的,7,次方成反比,在分子间相互作用中，只有非常接近，而且有众多原子或基团时，方能出现作用。换句话说，范德华力是非特异性的作用力，分子越复杂，原子或基团间接触点越多，其引力总和越大,根据热力学计算，甾类化合物与受体结合能的主要来源是范德华力与疏水作用,4.疏水作用,疏水作用是有机分子在水溶液中，由于有机基团间的静电力、氢键、范德华力的作用，使有机分子倾向于聚集在一起，因而产生排斥水分子的作用,就配基和受体而言它们的非极性部分在体液中均为水合状态。当配基与受体接近到某一程度时，非极性部分周围的水分子便被挤出，被置换出来的水分子成无序状态因而体系的熵增加，焓变值减少，使两个非极性区域间的接触稳定，这种缔合就是疏水基团相互作用的结果,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,构型,(,configuration),和构象,(,conformation),构型描述的是有机光学活性分子中，手性中心上相连接的各个原子和基团，相对位置不同所产生的立体异构现象,构象是指组成分子的各个原子和基团间的相对空间位置,构型的改变，分子中一定会有共价键的断裂和新的共价键的生成；而构象的改变不需要共价键的变换,构型概念仅涉及与手性中心相连的各个原子和基团的相对位置，没有手性中心就不存在分子的构型；而构象概念涉及分子中所有原子和基团，由于分子中单键的旋转，一些原子和基团的相对位置可有多种差异，因而一个分子可有多种构象体,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,结构决定功能，受体与配基相互作用的强弱与受体的结构，特别是与其空间结构密切相关,受体蛋白质立体结构的研究，主要是对其构象的研究。一条受体蛋白质的多肽链只有通过折叠成特定的空间构象，才有功能可言,所谓受体的活性，实际上就是受体的活性构象，对受体与配基相互作用的研究也是主要围绕着受体的构象展开的,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,受体和配基的相互作用有着严格的立体化学要求。这一作用过程遵守两个关键的原则:,一是互补性原则（,complementarity,）。,配基与受体的互补包括空间结构的互补性及电性特征的互补性。空间结构的互补既含静态也含动态和诱导契合，也可称为构象的重组织。在电性特征方面是指在氢键的形成、静电相互作用、,键的堆积及疏水作用中键合位点上电荷分布的最佳匹配,二是预组织原则（,preorganization,）。,它是指受体与配基作用之前，受体容纳配基的环境的组织状态。这个动态过程完成得越好，受体与配基之间所形成的复合物越稳定,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,受体与配基具有生物效应的相互作用应该具备如下特点：,首先，受体、配基双方接触面积要大。在受体作用位点附近应该有足够的包容小分子的空间，有机会产生较多的非共价相互作用，增加可结合位点，以提高选择性,其次，配基和受体之间只有分子间或原子间的相互作用,而不形成新的共价键。所以配基与受体必须在空间结构和电性特征上有很强的互补性才能产生有效的作用,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,第三，必须照顾到刚性与柔性的平衡。受体分子结构的稳定性需要刚性的分子结构，但是作用过程中构象的转换、变构过程以及调控、协同作用都需要具备一定的柔性，特别是在生物体系中受体分子的柔性是非常重要的。柔性也是一个动态性质的表征，有柔性才会发生构象重组织。照顾到刚性与柔性的平衡，也是兼顾了动态及静态两方面的性质,1.3.2,受体与配基相互作用的立体结构问题,为了在分子水平上描绘配基与受体作用的可能方式，在考虑到受体蛋白结构的构型和构象问题以后，还必须考虑与其相结合的配基或药物在光学异构、几何异构、构象等方面与之相适应，否则将会无效,抗高血压药甲基多巴胺只有,L-,型有活性，,D-,型多巴胺是无活性的光学异构体,己烯雌酚是,E-,型有活性，,Z-,型己烯雌酚是无活性的几何异构体,组胺分子有两种构象，以歪扭,(,gauche),构象作用于,H,1,受体，而以反式,(,trans),构象作用于,H,2,受体,。,多巴胺，几茶酚胺也有类似情况,