红细胞免疫功能及其测定方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,红细胞免疫功能及其测定方法,汇报人：王 翀,在肿瘤的发生发展过程中免疫功能起着重要的作用，过去的观点认为免疫功能主要和白细胞有关，而红细胞在其中所起的作用一直未受重视。,1981,年,siegel,提出了红细胞免疫系统的新概念，开辟了机体免疫功能研究的新纪元。红细胞作为人体血液有形成份的主要组成部分与肿瘤细胞的接触机会比其他细胞要大,1000,倍。红细胞可以通过促吞噬作用、清除循环免疫复合物,(CIC),、效应细胞样作用及对淋巴细胞和细胞因子的调控作用来达到抑制肿瘤的生长和转移的作用。在正常情况下，红细胞免疫和白细胞免疫,(,如,T,细胞、,B,细胞、,NK,细胞、巨噬细胞,),在机体内相互联系、密切配合、协同作战，识别和清除肿瘤细胞，共同维持机体内环境的平衡和生物功能的稳定。,1,红细胞与其它免疫反应细胞的比较,红细胞与其它血细胞均来源于骨髓造血干细胞。以往认为虽然它们来源相同，但功能各异，前者主要是运输气体，而后者则参与免疫和防御机制。目前研究表明，红细胞不仅具有呼吸功能，且同白细胞一样具有免疫功能。,2,红细胞的免疫功能,2.1,增强吞噬作用,纳尔逊,(Nelson),用肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验，发现被相应抗体致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋体，只有在含补体、红细胞及白细胞的混合物中，80,95,能迅速被吞噬而从液相中消失；若缺少红细胞，则在较长时间内仅有少数被吞噬。,1956,年,Nelson,又将抗体调理过的肺炎球菌注入猴体内，获得的结果与体外实验相同，,100,的肺炎球菌粘附于红细胞。,粘附的复合物较悬浮于血浆中游离的复合物更易被吞噬。某些病毒在体内也能粘附于红细胞，从而被吞噬消灭。免疫粘附可以增强吞噬作用,4,5,倍。红细胞还能阻止癌细胞在循环中播散，因在外周血中癌细胞遇到红细胞比遇到白细胞的机会多,500,1000,倍。当癌细胞表面结合有抗体与补体时，则可通过红细胞表面的,C3b,受体，使癌细胞粘附于红细胞，故容易被吞噬细胞捕捉与吞噬，从而防止癌细胞的转移与扩散红细胞还有吞噬细胞样的功能，因为在其细胞膜表面具有过氧化物酶，该酶是典型的溶酶体酶，它可起着巨噬细胞样的杀伤作用。,2.2,红细胞的免疫粘附作用,免疫粘附,是指抗原,-,抗体复合物与补体,C3b,结合后，可粘附于灵长目或非灵长目的红细胞与血小板上，这一现象统称为“血细胞免疫粘附作用”。红细胞的免疫粘附活性是通过,I,型补体受体（,complement receptor type I,，,CR1),为基础实现的。血循环中免疫复合物,(IC),的清除主要由红细胞,CR1,携带至肝脾网状内皮系统交给巨噬细胞消灭。,CR1,成簇分布，人类每个红细胞大约表达,200,500,个,CR1,分子，主要配体为,C3b,。该受体为糖蛋白，分子量为,205,，,000,。红细胞上的,C3b,受体占血循环中,C3b,受体总数的,95,以上。因此，血循环中的抗原,-,抗体复合物遇到红细胞比遇到白细胞的机会多,500,1 000,倍。,2.3,防御感染,红细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通过过氧化物酶对它们产生直接的杀伤作用，而且还可以促进吞噬细胞对它们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫功能可以看作是机体抗感染免疫的因素之一。,小结：,目前已知红细胞具有以下免疫功能：,(1),识别携带抗原；,(2),清除循环中免疫复合物；,(3),增强,T,细胞依赖反应；,(4),效应细胞样作用；,(5),促进吞噬作用。而这些免疫功能的生理学基础即为红细胞免疫粘附作用。,3,红细胞免疫功能异常与疾病,近年研究证实在某些病理状态下，红细胞的免疫粘附活性可发生改变。,Siegel,等检查了,23,名宫颈癌、胃癌和直肠癌患者的红细胞免疫粘附功能，发现这些患者的红细胞粘附抗原,-,抗体,-,补体复合物的能力较正常人显著降低。这一资料提示在肿瘤的发展过程中，除可抑制白细胞免疫功能外，还可抑制红细胞的免疫功能。,系统性红斑性狼疮（,SLE,）、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应所致。一般认为，自身免疫病患者的细胞免疫和,/,或体液免疫功能处于相对增强状态。通过对此类病人红细胞免疫系统的研究结果表明，其免疫功能亦明显增强，且与白细胞免疫系统的功能改变相平行，这可能与自身免疫病患者血清中存在着红细胞,C3b,受体活性抑制因子有关。,目前认为原发性癫痫和银屑病的发病也与自身免疫有关。郭峰等曾观察到这两种疾病患者的红细胞免疫功能的变化与,SLE,等其它自身免疫病患者是一致的。,另外，再生障碍性贫血的患者，其红细胞的免疫粘附作用降低，可能是由于患者造血功能障碍，所产生的红细胞数量少而且质量低劣，致使红细胞膜上的,C3b,受体生成不足。慢性布氏菌病患者，其红细胞免疫功能亦降低，致使清除感染因子的能力减弱，这种现象可能是引起该病经久不愈的原因之一。,4,红细胞免疫功能的检测及其临床意义,4.1,红细胞,C3b,受体的测定,原理：,红细胞膜上的,C3b,受体,(CR1),可与补体致敏的酵母菌粘附形成花环,(RBC-C3bR,花环,),；同时红细胞膜上粘附的,IC,中,C3b,分子或抗原补体复合物中的,C3b,分子可与未致敏的酵母菌的酵母多糖粘附形成花环（,RBC-IC,花环）。,意义：,RBC-C3bR,花环率和,RBC-IC,花环率可作为红细胞天然免疫粘附功能的指标。,（,1,）若两项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下，为红细胞膜,C3b,受体受到破坏或遗传基因缺陷及其他影响所致。,（,2,）若,RBC-C3bR,花环率降低，而,RBC-IC,花环率增高，则为继发性红细胞免疫功能低下，是由于红细胞,CR1,上免疫复合物或补体调理的抗原量增加所致。,（,3,）若这两项指标都上升，判断为红细胞天然免疫功能亢进与紊乱。,4.2,红细胞,CR1,数量的测定,4.2.1,红细胞,CR1,密度相关基因多态性测定方法,DNA,提取,PCR,扩增,限制性片段长度多态性酶切分析（,RFLP,分析）,琼脂糖凝胶电泳,4.2.2,红细胞,CR1,流式细胞仪测定方法,原理：单个红细胞,CR1,数量比白细胞,CR1,低，为了提高试验的敏感度，采用间接免疫荧光染色法流式细胞仪检测技术。用鼠抗人红细胞,CR1,单抗与一定量待测纯红细胞数反应洗涤，再加羊抗鼠,IgG,荧光标记抗体反应洗涤后，上流式细胞仪测定，算出荧光染色红细胞平均强度，为红细胞,CR1,数量指标。,具体操作程序：,在编号试管中分别加冷,PBS 50 l,，加入鼠抗人红细胞,CR1(CD35),单抗,1.5 l,及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血,0.5 l,，充分吹打混匀，置室温下避光,30 min,。加入,PBS,液,2 ml,，,1500 r/min,离心,5 min,，弃上清液；加入荧光素标记的第二抗体,羊抗鼠,IgG,-FITC 1 l,，吹打混匀，置室温下避光,30 min,；再加入,PBS,液,2 ml,，充分混匀、洗涤，,1500 r/min,离心,5 min,，弃去上清夜后加入,PBS 300 l,，混匀后置流式测试管中，严格按照流式细胞仪操作程序测定样品和对照品，在计算机屏幕上显示或记录各待测标本红细胞平均荧光强度。,意义：红细胞,CR1,数量流式细胞仪测定结合,CR1,基因多态性及红细胞,CR1,活性测定，对临床上红细胞免疫功能缺陷与亢进分型更为客观，对临床辅助诊断及疗效指标都具有重要应用价值。,4.2.3,红细胞,CR1,单抗免疫酶联法（,ELISA,法）,5,正常红细胞与异常红细胞毛细管电泳分离,能直接反映颗粒电性质的毛细管电泳具有高效、简便、灵敏度高、样品消耗少等优点，在生化领域已经广泛应用于蛋白质及其衍生物、肽类、氨基酸、糖类物质、无机离子、手性物质等的分离与分析。,运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的异常红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细胞。,样品制备,1),正常红细胞悬浮液,用含,6%,葡萄糖的,0.1mol/L,，,pH 7.4,的磷酸盐缓冲液稀释红细胞，通过血球板计数法，确定细胞浓度为,1.8610,7,个,/,mL,。,2),异常红细胞悬浮液,取上述浓度红细胞,0.2,mL,与,H1N1,甲亚型流感病毒,0.02,mL,充分混合，常温,(25),下反应,1,。,电泳条件,每天运行前用,0.1 mol/L,HCl,、,0.1 mol/L,NaOH,、水、缓冲液分别洗柱,3,、,6,、,3,、,3 min,；每轮运行前均用,0.1 mol/L,NaOH,、水、缓冲液分别洗柱,3,、,1,、,1 min,；结束实验时用,0.1 mol/L,HCl,、,0.1 mol/L,NaOH,和水分别洗柱,5,、,10,、,5 min,，最后将毛细管内壁吹干保存。正极进样，负极检测，均在室温下进行。进样压力,3.448,kPa,，进样时间,5 s,；分离电压,20 kV,；紫外检测波长,214 nm,；分离温度,25,。,感染病毒后，在病毒作用下红细胞表面荷电量会发生改变，致使细胞电泳速度和,zeta,电位发生改变。实验证明，被病毒感染的红细胞与正常的红细胞的出峰时间有明显的差别（被病毒感染的红细胞出峰时间要比正常的红细胞出峰时间晚），且峰形有了显著的变化。,细胞的电泳行为与细胞表面的电荷量直接相关，而细胞表面的电荷量是由细胞膜上的生物大分子的化学基团的离子化和表面吸附的离子决定的，病变的细胞其表面成分发生改变，其带电性也有所改变，因此通过检测细胞的电泳行为，了解细胞损伤程度，有助于预测疾病的发生。,谢 谢！,