3-2-基因工程的基本操作程序3-课件高二下学期生物人教版选择性必修.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0,3.2,基因工程的基本操作程序,1.,基因工程的基本操作程序,2.,基因工程每一步涉及的技术和方法,目的,基因的筛选,和获取,-,前提,利用,PCR,获取和扩增,化学方法人工合成,构建基因表达,载体,-,核心,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体,细胞,-,关键,花粉管通道法,(,植物,),、农杆菌转化法,(,植物,),、显微注射法,(,动物,),、,感受态细胞转化法,(,微生物,);,目的,基因的检测与,鉴定,-,保证,分子检测,：是否插入、转录、,翻译,个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。,4.,目的基因的检测与鉴定,1.,在实际种植过程中，棉铃虫是否对转,Bt,基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？,科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，,如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。,在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。,2,.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？,科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。,（1）基因策略。,该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。,（2）田间策略。,这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）,轮作或套种等。,（,3,）,国家宏观调控策略。,该策略包括,实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生评价,等。,1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。,（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（,）,（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（,）,（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（,）,2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（,）,A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶,B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶,C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则,D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸,D,1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。,外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。,2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crt表示）参与-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crt基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。,（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctr和,psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒,pSYN12424。该项研究的目的基因是,_,_,，标记基因是_,_,_，质粒pSYN12424的作用是_,_,_。,ctr基因和psy基因,pmi基因,将目的基因送入水稻细胞,（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？,不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。,(3),请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 黄金大米”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。,维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。-胡萝素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与-胡萝素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含-胡萝素期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广黄金大米”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开,。,1,下列有关基因工程技术的正确叙述是（）,A,重组,DNA,技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体,B,所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列,C,选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快,D,只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达,C,2.,科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒,DNA,分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。胰岛素基因与大肠杆菌质粒,DNA,结合的位置，它们彼此能结合的依据是 （）,A基因自由组合定律,B,半保留复制原则,C,基因分离定律,D,碱基互补配对原则,D,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,1.DNA体外扩增的原理：,PCR利用,DNA热变性原理,，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。,PCR仪,实质上就是一台能够,自动调控温度,的仪器，一次PCR一般要经历,30次,循环。,2.DNA片段电泳鉴定的原理：,DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,，这个过程就是,电泳,。,在凝胶中DNA分子的,迁移速率,与,凝胶的浓度、,DNA分子的大小,和构像,等有关。,凝胶中的DNA分子通过,染色,，可在波长为300nm的,紫外灯,下被检测出来。,如何对,PCR,产物进行鉴定吗？,琼脂糖凝胶电泳,（,1,）,仪器,（,2,）,用具,PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）,4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等,3.,材料用具,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,3.,材料用具,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,PCR,反应体系的配方,10,倍浓缩的扩增缓冲液,5,L,20 mmol/L,的,4,种脱氧核苷酸的等量混合液,1,L20,mol/L,的引物,2.5,L,20,mol/L,的引物,2.5,L,H2O,28,33,L,1,5 U/,L,的,Taq DNA,聚合酶,1,2 U,模板,DNA,5,10,L,总体积,50,L,注：模板,DNA,的用量为,1gp,1,g,4.,方法步骤,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,用,微量移液器,按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在,微量离心管,中依次加入各组分。,1.PCR,加样：,待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，,离心,约10s，,使反应液集中在离心管的底部,。,循环程序,变性,复性,延伸,预变性,94,，,5min,30,次,94,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最后,1,次,94,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,2.,离心,：,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,4.,方法步骤,3.扩增,：,将装有反应液的微量离心管放入,PCR仪,中进行反应。,根据,待分离DNA片段的大小,，用电泳缓冲液配制,琼脂糖溶液,，一般配制质量体积比,0.8%-1.2%,的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内,加热至琼脂糖熔化,。稍冷却后，加入适量的,核酸染料,混匀。,4.配制琼脂糖溶液,：,参照,下,表的参数，设置好PCR仪的循环程序。,将,温热,的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的,梳子,，以形成加样孔,。,凝胶溶液完全凝固，小心,拔出,梳子，取出凝胶,放入电泳槽,内。,5.,制备凝胶,：,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,4.,方法步骤,将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液,没过凝胶1mm为宜。,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,4.,方法步骤,将扩增得到的,PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）,混合，再用微量移液器将混合液缓慢,注入凝胶的加样孔,内。,留一个加样孔,加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。,6.,电泳,加样,：,7.,电泳、观察,：,接通电源，,根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压,，一般为,15V/cm,。待指示剂前沿迁移,接近凝胶边缘时,，停止电泳。取出凝胶置于,紫外灯,下观察和照相。,注意事项,1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行,高压灭菌,处理。,2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在,-20,储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。,3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的,枪头都必须更换,。,4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。,例,1,：,用,PCR,方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中,1,号为,DNA,标准样液,(Marker),，,10,号为蒸馏水。,PCR,时加入的模板,DNA,如图所示。据此做出分析不合理的是,(,),A.PCR,产物的分子大小在,250,至,500 bp,之间,B.3,号样品为不含目的基因的载体,DNA,C.9,号样品对应植株不是所需的转基因植株,D.10,号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰,B,5.,DNA片段的扩增及电泳鉴定,