CIK细胞免疫治疗.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,CIK细胞免疫治疗,我国肿瘤现状,癌症对人类健康和生命的威胁很大，它和心血管疾患已成为医学上的两大难关，在全世界构成死亡原因的头两位。全世界,52,亿人口中，每年约有,700,万人新患癌症，每年约有,500,多万人死于癌症，几乎每,6,秒钟就有一名癌症患者死亡。我国目前每年平均约有,150,万人新患癌症，每年约有,80,万人死于癌症，其中,肺癌,、胰腺癌、,肝癌,、鼻咽癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤等，近年来有上升的趋势，由于防癌措施的普及，宫颈癌、睾丸癌症、,白血病,等有下降的趋势。,我国恶性肿瘤发病现状及趋势中国肿瘤，,2012.2,肿瘤,手术,化疗,放疗,生物治疗,细胞因子治疗,免疫细胞治疗,基因治疗,分子靶向治疗,抗体治疗,The Three Phases of the Cancer Immunoediting Process,Dunn GP,et al.Immunity,Vol.21,137148,August,2004,生物治疗的原理,免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞,(,有的突变细胞会变成癌细胞,),。机体免疫系统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强大足以及时清除突变的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑患者的免疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，癌症的免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异味性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的目的。,Virchow,对肿瘤免疫渗透进行了描述,首次报道了异基因骨髓移植,Burnet,肿瘤免疫监视假说,Coley,利用细菌产物治疗癌症,Zinkernagel和Doherty,发现MHC 限制性CD8+细胞识别,Steinman发现树突状细胞,Bevan发现交叉递呈,首次研究膀胱癌BCG,IL-2的首次研究,首次研究癌细胞的过继转移治疗,IFN在黑色素瘤中的首次研究,Bosenberg和Boon，人类肿瘤相关抗原的表征,利用TFN对黑色素瘤和肉瘤隔离灌注的首次研究,Sakaguchi再次发现调节细胞,发现Toll样受体的免疫功能,黑色素瘤的清髓性化疗和过继性细胞转移治疗,免疫调节剂被用于治疗VIN,VIN中人类乳头瘤病毒疫苗,FDA批准sipuleucel-T治疗前列腺癌，批准Ipilimumab治疗黑色素瘤,重要的基础免疫发现和关键临床试验,肿瘤免疫治疗的发展历程,免疫细胞类型,细胞因子诱导的杀伤细胞（,CIK,）,肿瘤抗原致敏的树突状细胞（,DC,）,DC,细胞与,CIK,细胞混合培养诱导出来的细胞（,DC-CIK,）,肿瘤浸润淋巴细胞（,TIL,）,自然杀伤细胞（,NK,）,以上免疫细胞皆已临床应用,介绍,Introduction,介绍,Introduction,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）,CIK细胞是将人体外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。,CIK细胞具有以下特点：,增殖能力强杀瘤活性强,杀瘤谱广,对正常骨髓造血前体细胞毒性小,CIK细胞的杀瘤机制：,对瘤细胞直接杀伤,诱导肿瘤凋亡,活化后产生大量细胞因子的抑制杀瘤作用,激活机体免疫系统，提高机体免疫功能,CIK细胞的杀瘤机制,CIK,细胞中的效应细胞是,CD3+,和,CD56+,细胞，在正常人外周血中极其罕见，仅,1%5%,。,在体外经多因子培养,2,到,3,周，,CD3+CD56+,细胞迅速增多，较培养前升幅可达,1000,倍以上。,CIK,细胞治疗属于过继细胞免疫疗法，由于,CIK,细胞溶瘤作用是非,MHC,限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀伤作用，但对高抗原表达的癌症疗效最好。,CIK,细胞治疗适应症,CIK细胞治疗适应症,：,主要用于恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等。,适应人群：,除个别针对儿童复发肿瘤治疗外，患者年龄16岁,；,生活自理，卡氏评分60分,；,预计生存期3个月,；,签署知情同意书,；,放化疗结束2周以上（个别病例具体分析）,。,Karnofsky,（卡氏，,KPS,，百分法）功能状态评分标准,体力状况,评分,正常，无症状和体征,100,能进行正常活动，有轻微症状和体征,90,勉强可进行正常活动，有一些症状或体征,80,生活可自理，但不能维持正常生活工作,70,生活能大部分自理，但偶尔需要别人帮助,60,常需人照料,50,生活不能自理，需要特别照顾和帮助,40,生活严重不能自理,30,病重，需要住院和积极的支持治疗,20,重危，临近死亡,10,死亡,0,CIK,细胞治疗禁忌症,自身免疫性疾病患者,T,细胞淋巴瘤患者,对治疗中所用生物制剂过敏者,怀孕或哺乳期妇女,器官功能衰竭及脏器移植者,不可控制的感染性疾病,细胞治疗示意图,CIK,细胞的体外来源,血液的来源：,患者自体血或家属血（60ml）,中心血站申请血库血（浓缩白细胞1U）,血液的检查：,血常规检查、血凝四项等,血型检测-A/B/O、Rh血型检测，自体血之外的必须血型匹配,常见病毒检测-H,A,V、H,B,V、梅毒、HIV等检测,病人采血前注意事项,病人清晨抽血前可以进食，但勿食用油腻食物；,抽血前不能输液；,抽血前病人没有任何感染及心肺肝功能异常；,手术病人术前取血；,放、化疗病人血象正常后取血；,淋巴细胞绝对值,0.8,不能取血，,0.8,可以取血。,仪器：超净台或生物安全柜，离心机、水浴锅、微波炉、天平、移液枪、显微镜,准备材料：剪刀、镊子、培养瓶，离心管,/,架，,5ml/10ml/25ml,移液管，滴管,试剂：,CIK,培养基，生理盐水，硫酸庆大霉素，各种细胞因子等,消毒用品：,75%,酒精，无菌纱布，酒精棉球,分离PBMNC,病人自体血,或家属血,血库血,淋巴分离液,密度梯度离心,2000rpm，20min,血浆,单个核细胞,分离液,红细胞吸出单个核细胞，生理盐水,洗涤23次，1500rpm，10min,血浆于56 灭活30 min,后，3000 rpm，10 min；,4 保存备用,CIK细胞培养流程,D,0,天补30,ml进T75包被培养瓶,24,h后加,细胞因子，并,补,液,至40,ml,D,4,或D,5,天视细胞情况一扩二或三,，,补液至每瓶120,ml,D,2,天进T175培养瓶补液至100,ml,D,6,或,D,7,天一扩二,D,8,或,D,9,天一扩二,D,9,或,D,10,天取样送检并扩增一扩二,D,10,或D,11,天一扩,二,D,13,或,D,14,天回输,根据细胞培养情况补液20或30 ml,回输,CIK细胞回输时的一些准备工作,回输前的准备：,医生填写治疗申请单，病人或家属签字知情同意书,护士核对科室、病人姓名、住院号、床号、血型等,回输时的注意事项：,用输血器回输，前,15min,缓慢滴注（,2030,滴,/,分钟），无反应后按,60,滴,/min,滴入，回输过程中观察患者有无其他反应,回输后的注意事项,：,回输结束后，应留院观察,2h,左右,CIK,细胞治疗的副反应及处理,常见的副反应：,一过性发热，常在输入后4-8h内发生，持续2-8h；,其它的副反应：乏力和全身不适等，较少见；出现寒战可肌注25mg异丙嗪,。,发热的处理：,体温38.5，温水擦浴，必要时肌肉注射20mg苯海拉明或12.5mg非那根；,回输的穿刺点如有红肿、疼痛、皮温升高、硬结予以50%Mg,2,SO,4,湿敷即可。,谢谢！,人体外周血单核细胞分离,（,SOP,）,操作步骤：,50 ml离心管中加入15 ml淋巴细胞分离液；,用吸管吸取血样沿管壁缓慢加于淋巴细胞分离液液面上，注意此过程中不能把血液与分离液间的界面破坏，保持界面的清晰；,配平后，于2000 rpm离心20 min；,离心结束后，管内液体分四层，从上到下分别为血浆、单核细胞、分离液和红细胞，缓慢吸取上层血浆，置于离心管内于56 灭活30 min后，于3000 rpm离心10 min，4 保存备用,将滴管插到云雾层，吸取单核细胞至另一个离心管中加入1#试剂50ml，于1500 rpm离心10 min；,倾出上清液，再用1#试剂50 ml重悬细胞，洗涤23次；,计数细胞总数和测定细胞活力，备用；,最后将清洗干净的单核细胞转入隔天已包被好的细胞培养瓶中培养。,注意事项：,整个过程要严格无菌操作；,将血加入淋巴细胞分离液时，必须保持两种液体界面清晰；,用滴管吸取淋巴细胞层时，要掌握好力度，在细胞层上作各方向吸取，勿吸入其他层液体；,操作应轻柔，细胞悬液要充分混匀，避免损伤细胞活力及丢失细胞。,CIK,细胞制备（,SOP,）,取血库浓缩白细胞血,1U,（或自体血,60,ml）；,用人淋巴细胞分离液，11或11.5分离单核淋巴细胞，2000 rpm离心20 min，取上层血浆至另一50 ml离心管内，于56 灭活30 min，3000 rpm离心10 min，4 保存备用；,吸取白环层单核淋巴细胞，置50 ml离心管内，用1号试剂，洗涤23次，2000 rpm离心10 min；,用2号试剂调节细胞浓度至2-310,6,/ml；,加入已包被CIK-1的75 cm细胞培养瓶内培养，每瓶30 ml；,24 h后，补加培养基10 ml（内含CIK-3、CIK-4、CIK-5各一支）；,再培养2448 h后，视细胞状态用CIK培养基，将细胞一扩二培养；,8.,以后每23 d传代一次。10 d后，取细胞悬液送外检（检测细菌、真菌、支原体，结果为阴性方可用）；,9.,14 d后，收集细胞，用于细胞治疗；,10.,收集治疗：将生长旺盛的CIK细胞，收集，离心，留样并进行无菌检验，洗涤23次，计数细胞数和测定细胞活力（每次输入细胞数要210,9,，细胞活力95%）；,11.,用,一次性,无菌滤器,过滤细胞；,12.,将细胞悬浮于50100 ml的生理盐水中IL-2 10万单位人白蛋白10 ml，混合，封口，用输血速度给病人静脉滴注，2 h内输完；,13.,一个疗程为5次，病人可连续输入细胞，也可隔天输入（临床医生决定）。,培养到,7,天的,CIK,培养到,11,天的,CIK,