醋纤膜电泳(hxj).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血清蛋白质 醋酸纤维素薄膜电泳,（,Electrophoresis on cellulose acetate membrane of serum proteins),实验目的,1,、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理,2,、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质,的实验操作技术和注意事项。,3,、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳,的优点及使用范围。,电泳技术,电泳：,溶液中带电粒子在直流电场向着电极相反方向移动的现象称为电泳（,electrophoresis,）。,电泳技术,是利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的一项技术。,电泳的分类,按分离目的：分析电泳和制备电泳,按电场强度：常压电泳和高压电泳,按电泳媒介：自由电泳和区带电泳,区带电泳（按支持介质）：淀粉凝胶电泳,滤纸电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,按支持介质形式：水平式电泳、垂直电泳,按缓冲液,pH,值：连续,pH,和不连续,pH,电泳,临床电泳项目,临床上以琼脂糖电泳法开展的电泳项目：,血清蛋白电泳,免疫固定电泳,尿蛋白电泳,同工酶电泳,脑脊液寡克隆电泳,本周氏蛋白电泳,脂蛋白电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做,醋酸纤维素薄膜电泳,。,醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为,120m,，,通透性好,，,对分子移动阻力少,，是一种良好的电泳支持物。,醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用,具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。,用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如,血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶,等的分离鉴定。,原 理,血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于,pH7.4,。它们在,pH8.6,的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为,清蛋白（,Albumin),、,1,-,球蛋白、,2,-,球蛋白、,-,球蛋白、,-,球蛋白,5,条区带。,血浆蛋白质的等电点、平均相对分子量、及正常含量,球 蛋 白,清蛋白,A,1,2,pI,相对分子量,（,10,4,）,含量（,%,）,4.88,6.9,5772,5.06,20,25,5.06,30,49,5.12,915,6.212,6.857.3,15.630,1220,实验材料,健康人血清或动物血清,试剂,1,、,pH8.6,巴比妥缓冲液,2,、氨基黑,10B,染色液,3,、漂洗液,4,、洗脱液,5,、透明液,（试剂配制参见实验讲义）,定量时用,仪器和器材,1,、常压电泳仪、电泳槽,2,、醋酸纤维素薄膜（,28cm,）,3,、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板,4,、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）,5,、滤纸,6,、镊子,7,、试管、试管架、吸量管,8,、分光光度计,（定量用）,操作步骤,1,、薄膜准备,将醋酸纤维素薄膜切成,28cm,的小条。,在薄膜粗面一端,1.5cm,处用铅笔轻轻画一横线。,在薄膜角上用铅笔作一标记。,将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中,20min,。,操作步骤,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置,8cm,2cm,点样线,点样区,1.5cm,(,粗面）,点样线,尽量点得细窄而均匀,宁少勿多,用铅笔做好标记（组号以及蛋白名称）,操作步骤,2,、电泳仪准备,在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。,操作步骤,3,、点样（电泳的关键步骤）,用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血清中沾一下，再在膜条点样线处,轻轻地水平落下并随即提起这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。,点样线,尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。,操作步骤,4,、上槽,待血清吸入膜后，以薄膜,粗面向下,、,点样端置阴极端,，两端紧贴在滤纸盐桥上，,膜应轻轻拉平,，加盖，平衡约,5min,，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。,切勿使点样处与电泳槽接触,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,操作步骤,5,、电泳,检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电,4060min,。,电压：,110130V,（,10V/cm,膜长）,薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。,电流：,0.40.6mA/cm,膜宽,有数条膜便求数条膜宽的总和。,操作步骤,6,、染色和漂洗,电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中,5min,。,取出膜，,尽量沥净染色液,，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换,23,次），,至背景颜色脱净为止,。,取出膜，用滤纸吸干即可。,操作步骤,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱,电泳方向,A,1,2,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果,操作步骤,7,、透明,薄膜完全干燥后，浸入透明液中,20min,后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。,操作步骤,8,、定量（略）,洗脱比色法,光密度计扫描法,血清蛋白电泳,光密度扫描,临床意义,1,、,M,蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在,-,球蛋白区、,-,球蛋白区或两者之间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰的,M,蛋白带,。,2,、蛋白质缺乏症,3,、肾病,4,、急慢性炎症,5,、肝病：,肝硬化出现,“,-,桥,”,原发性肝癌在,Alb,与,1,-,球蛋白之间出现一小的区带，称为,甲胎蛋白带,。,几种疾病的蛋白电泳变化,病名,Alb,1,2,肾病,肝硬化,原发性肝癌,多发性骨髓瘤,慢性炎症,无丙种球蛋白症,双白蛋白血症,AFP,-,桥,操作流程,1,、薄膜准备,2,、电泳仪准备,3,、点样,4,、上槽,5,、电泳,6,、染色及漂洗,注意事项,1,、最好选用同一批号、厚薄均匀、质量良好的醋纤膜。,2,、样品要新鲜。,3,、点样要细窄、均匀、集中。,4,、盐桥要平整。,5,、电泳槽盖要密封。,6,、室温不宜过高。,注意事项,7,、选择合适的缓冲液离子强度。,8,、两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面。,9,、要控制好电压、电流和电泳时间。,10,、电泳槽内两极溶液要交替使用，操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、,pH,及离子强度的改变，防止霉菌的滋长。,思考题,1,、以醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？,2,、简述肾病综合征、慢性肝炎及肝硬化患者的血清蛋白电泳结果可能出现怎样的改变？,