肺腺癌组织中赖氨酸乙酰转移酶5、鼠双微体2表达观察.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 30 期肺腺癌组织中赖氨酸乙酰转移酶 5、鼠双微体 2表达观察黄景涛，孙龙飞，郑竞雄，米良，梁宗英承德医学院附属医院胸外科，河北承德067000摘要：目的观察肺腺癌组织中赖氨酸乙酰转移酶5 K（lysine）acetyltransferase，KAT5 和鼠双微体2（Murine double minute2，MDM2）的表达变化，探讨其临床意义。方法60例通过手术切除且经过病理学确诊肺腺癌患者，留取癌组织和癌旁肺组织。采用荧光免疫组织化学法对肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2进行定位检测，采用免疫组织化学法对肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2进行半定量检测，分析KAT5、MDM2阳性表达与肺腺癌患者临床病理参数的关系，采用Spearman相关检验法分析肺腺癌组织KAT5、MDM2表达的相关性。结果相比于癌旁组织，肺腺癌组织中 KAT5、MDM2 高表达。肺腺癌组织及癌旁组织 KAT5 阳性表达率分别为 65.00%（39/60）、45.00%（27/60），二者比较，P0.05；MDM2阳性表达率分别为78.33%（47/60）、40.00%（24/60），二者比较，P0.05。KAT5、MDM2 阳性表达与肺腺癌患者的 TNM 分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关（P 均0.05）。肺腺癌组织中 KAT5、MDM2的表达呈正相关（r=0.632，P0.05）。结论肺腺癌组织中 KAT5、MDM2呈高表达。KAT5、MDM2阳性表达与肺腺癌患者的TNM分期和淋巴结转移相关。KAT5、MDM2可能协同促进肺腺癌的发生发展。关键词：赖氨酸乙酰转移酶5；鼠双微体2；肺肿瘤；肺腺癌doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.005 中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）30-0021-04Expression of KAT5 and MDM2 in lung adenocarcinoma tissuesHUANG Jingtao，SUN Longfei，ZHENG Jingxiong，MI Liang，LIANG ZongyingDepartment of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，ChinaAbstract：Objective To observe the expression changes of K（lysine）acetyltransferase（KAT5）and murine double minute 2（MDM2）in lung adenocarcinoma tissues，and to explore their clinical significance.Methods Sixty cases of patients who were pathologically confirmed as lung adenocarcinoma were selected，and their lung adenocarcinoma carcinoma and normal lung tissue were collected to detect the localization and semi-quantitation of KAT 5 and MDM 2 by fluorescence immunohistochemistry（IF）and immunohistochemistry，respectively.We analyzed the relationships between positive expression of KAT5 and MDM2 and clinicopathologic parameters of lung adenocarcinoma patients，and the correlation of KAT5 and MDM2 expression in lung adenocarcinoma tissues was analyzed by Spearman correlation test.Results The expression of KAT5 and MDM2 in lung adenocarcinoma tissues was higher than that in the adjacent tissues.The positive expression rates of KAT5 in the lung adenocarcinoma tissues and adjacent tissues were 65.00%（39/60）and 45.00%（27/60），respectively，with statistically significant difference（P0.05）.The positive expression rates of MDM2 were 78.33%（47/60）and 40.00%（24/60），respectively，with statistically significant difference（P0.05）.The positive expression levels of KAT5 and MDM2 were closely correlated with TNM stage，tumor differentiation degree and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma patients（all P0.05）.The expression of KAT5 and MDM2 in lung adenocarcinoma tissue was positively correlated（r=0.632，P0.05）.Conclusions KAT5 and MDM2 are highly expressed in lung adenocarcinoma tissues.The positive expression levels of KAT5 and MDM2 are correlated with TNM stage and lymph node metastasis in patients with lung adenocarcinoma.KAT5 and MDM2 may synergistically promote the development and 基金项目：河北省自然科学基金资助项目（H2021406045）。第一作者简介：黄景涛（1996-），男，硕士研究生在读，主要研究方向为肺癌发生的分子机制。E-mail：jingtao_通信作者简介：梁宗英（1981-），男，博士，副主任医师，主要研究方向为表观遗传学修饰在肿瘤发生发展过程中的分子机制。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）21山东医药2023 年第 63 卷第 30 期progression of lung adenocarcinoma.Key words：KAT 5；MDM 2；lung neoplasms；lung adenocarcinoma肺癌是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤1。肺腺癌是肺癌的重要病理类型之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，且预后差2。组蛋白乙酰化修饰是基因转录的重要调控方式，该调节影响核小体的动态过程，异常调控的乙酰化和癌症的发展有关。赖氨酸乙酰转移酶 5 K（lysine）acetyltransferase，KAT5 属于组蛋白乙酰化酶MYST家族，通过调节底物的稳定性及活性参与组蛋白的乙酰化修饰，参与多种肿瘤的发生发展3。癌组织中高表达的KAT5 可进一步促进 c-myc 表达，发挥促癌作用4。鼠双微体2（murine double minute 2，MDM2）是一个能促进细胞生长转化的癌基因，可以与P53结合，调节MDM2-P53负反馈环，调节细胞的增殖凋亡相关信号通路5。最新研究6发现，KAT5存在与MDM2特异性结合的泛素化结合位点，KAT5受泛素蛋白酶体途径的调节，MDM2可以蛋白酶体依赖的方式诱导KAT5的降解。目前探讨KAT5、MDM2在肺腺癌发生发展中的作用相关研究较少，鉴于既往研究中KAT5、MDM2的肿瘤促进作用。2022年10月2023 年 5 月，我们观察了肺腺癌组织中 KAT5、MDM2的表达变化，探讨其临床意义，现将结果报告如下。1 资料与方法 1.1临床资料选取2020年9月2022年3月承德医学院附属医院胸外科诊治的，做过手术切除且经过病理学诊断后确诊肺腺癌患者60例。纳入标准：手术前均未接受过任何放化疗及免疫治疗。临床资料完整。排除标准：伴有严重感染、严重肝功能异常或严重肾功能异常者；合并其他恶性肿瘤的患者或有其他恶性肿瘤史者；肿瘤切除术后，术后辅助治疗开始前出现疾病复发进展、死亡患者。60例患者中男23例、女37例；60岁38例，6 cm，病理证实无癌组织）。本研究已经得到承德医学院医学伦理委员会批准。1.2主要试剂MDM2和KAT5抗体购自于河北石家庄健菲生物科技有限公司；免疫组化试剂盒购自于广州德咏信生物科技有限公司；山羊血清、DAB显色试剂盒购自于河北贝博实验用品有限公司。Alexa Fluor 488-conjugated 羊抗兔荧光抗体、ATTO 594-conjugated羊抗鼠荧光抗体和抗荧光淬灭封片剂购自河北贝博实验用品有限公司。1.3肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5蛋白检测1.3.1肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5蛋白定位检测采用荧光免疫组织化学法（IF）。组织切片常规脱蜡水化，PBS清洗后，抗原修复暴露抗原表位，5%山羊血清封闭，甩去多余液体；加一抗（MDM2 1 300，KAT5 1 300），4 过夜，室温复温；PBST清洗；加荧光二抗（羊抗兔荧光抗体1 200、羊抗鼠荧光抗体1 200），孵育1 h，PNST清洗；DAPI染色5 min，PBST清洗3次3 min；滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下根据荧光的分布位置及强度，确定MDM2、KAT5蛋白的定位。每张标本随机取5个不重复高倍视野。结果判定标准：明场视野下确定组织位置，DAPI下确定细胞核，以定位在细胞膜和（或）细胞质，绿色荧光信号确定KAT5蛋白表达，红色荧光信号确定MDM2蛋白表达。1.3.2肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5蛋白定量检测采用免疫组织化学（IHC）法。取肺腺癌组织及癌旁组织标本石蜡连续切片，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。DAB显色，显微镜下控制显色时间。流水冲洗，苏木素复染核，中性树脂封片固定。以山羊血清替代一抗做阴性对照，已知阳性病例做阳性对照。MDM2、KAT5主要表达于细胞质中，少量表达于细胞核，将细胞核与细胞质中呈现棕黄色定为阳性，每张切片在光学显微镜下连续观察10个高倍视野。结果判定标准：阳性细胞染色定位在细胞膜和（或）细胞质，呈淡黄色、棕褐色颗粒。根据阳性细胞染色强度与阳性细胞数百分比进行评分。首先根据染色强度打分：无色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕黑色计3分，1分的为阳性细胞；再根据阳性细胞所占比例评分：阳性细胞率75%计分；2项评分的乘积进行表达定量分级：03为阴性表达，3为阳性表达。测算肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5细胞阳性率，阳性表达率为该组阳性表达数占该组总数的比例。22山东医药2023 年第 63 卷第 30 期1.4统计学方法采用 SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理。计量资料符合正态分布、方差齐时以-x s表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用2检验；采用Spearman相关检验法分析肺腺癌组织KAT5、MDM2 表达的相关性。P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果 2.1肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2定位情况癌旁组织KAT5、MDM2多数荧光强度不明显，肺腺癌组织中 KAT5与 MDM2均呈高表达，主要表达于细胞质中，少量表达于细胞核。2.2肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2阳性表达率比较肺腺癌组织及癌旁组织KAT5阳性表达率分别为65.00%（39/60）、45.00%（27/60），二者比较，P0.05。肺腺癌组织及癌旁组织；MDM2阳性表达率分别为78.33%（47/60）、40.00%（24/60），二者比较，P0.05），与肺腺癌患者TNM分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关（2分别为 14.336、6.507、4.319；P 均0.05）；MDM2高表达与肺腺癌患者TNM分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关（2分别为 11.231、9.133、6.000；P均0.05）。2.4KAT5 与 MDM2 在肺腺癌组织中表达的相关性Spearman 相关分析显示，肺腺癌组织中 KAT5蛋白表达与MDM2蛋白表达呈正相关（r=0.632，P0.05）。3 讨论 因肺癌发病隐匿且缺乏有效的早期筛查的分子标记物，部分肺癌患者发现时处于中晚期，影响患者的总体生存率和预后7。KAT5属于组蛋白乙酰化酶中的一员，在 DNA修复、细胞凋亡和蛋白乙酰化修饰中发挥着重要的作用。KAT5可以作为乙酰基转移酶通过乙酰化修饰肿瘤相关蛋白质，使其发生活性或功能改变，进而调控细胞的生长、信息传递及对环境因素刺激的应答反应等8。VAN DEN等9报告发现，KAT5在顺铂耐药的人肺癌细胞中过度表达，KAT5表达的下调使细胞对顺铂治疗敏感，并发现非小细胞肺癌的发生和 H4K5 和 H4K8 的大量乙酰化以及 H4K12 和H4K16的乙酰化减少有关。HPATEL等10研究发现KAT5在体内乙酰化C-MYC参与C-MYC激活，并确定KAT5通过乙酰化提高C-MYC蛋白稳定性可能在肺癌的发生中起促进作用。本研究结果表明，KAT5在肺腺癌组织中表达上调，且KAT5阳性表达与肺腺癌TNM分期、分化程度和淋巴结转移密切相关。这提示，KAT5在肺腺癌发生和发展过程中起到促进作用，可能通过乙酰化下游相关蛋白通过多种途径参与了肺腺癌的恶性转化。MDM2是肿瘤抑制因子 p53的负调节因子，转录因子 p53通过参与 DNA修复、细胞周期停滞、细胞衰老、细胞死亡、细胞分化和代谢来充当关键的肿瘤抑制因子11。MDM2基因编码的E3泛素连接酶可通过诱导下调促凋亡蛋白BAX和上调抗凋亡蛋白 Bcl-2 以及抑制一些肿瘤抑制因子（包括 p53、PTEN、p14ARF、GKN1和JWA）来抑制细胞凋亡进而参与肿瘤的发生12。MDM2基因扩增或MDM2蛋白表达改变是许多肿瘤的特征13。MDM2在多种肿瘤中呈高表达，且高表达与多种肿瘤的增殖、侵袭和迁移相关。ENDO 等14发现 MDM2 抑制剂 nutlin-3 与顺铂或5-氟尿嘧啶联合使用时具有抗肿瘤作用，并表1不同临床病理参数肺腺癌患者癌组织KAT5、MDM2阳性表达情况（例）临床病理参数性别 男 女年龄（岁）60 60吸烟 有 无淋巴转移 有 无TNM分期 期 期 期分化程度 高 中 低n2337382221392238232413 84111KAT5蛋白阳性1425221715241821 922 8 229 8阴性 91216 5 615 41714 2 5 612 3MDM2蛋白阳性1829281917302126132113 335 9阴性 5 810 3 4 9 11210 3 0 5 6 223山东医药2023 年第 63 卷第 30 期引发协同细胞毒性作用。NING等15证实在肺癌顺铂耐药性的研究中ZCCHC10可以减弱MDM2介导的 P53 泛素化降解抑制肿瘤进展。本研究结果表明，MDM2在肺腺癌组织中表达明显上调；MDM2阳性表达与肺腺癌的TNM分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关；MDM2在肿瘤有淋巴结转移者中表达明显升高，提示其可能促进了肺腺癌细胞自身的增殖、侵袭和迁移能力，进而使肺腺癌的恶性程度增强，导致其容易通过淋巴结发生转移。MDM2存在与KAT5特异性结合的泛素化结合位点，可以通过泛素蛋白酶体途径调节KAT5的降解8。DOHMESEN等16研究证实，MDM2与KAT5存在相互作用，KAT5可以作为 MDM2介导的 DNA损伤的特异性抑制物，但不能阻止 MDM2 介导的泛 素 化。DENG 等17发 现 Hp 感 染 诱 导 的MDM2 mRNA的ac4C乙酰化，稳定MDM2 mRNA，导致MDM2上调和p53降解，从而促进胃癌的发生，提示MDM2基因存在乙酰化位点。有研究表明乙酰转移酶p300/CBP相关因子（PACF）可以调控MDM2的蛋白水平来控制P53蛋白的稳定性和活性，在能量缺乏时，增强了PACF的E3泛素连接酶活性，用于结合并降解MDM2蛋白，稳定P53诱导细胞周期阻滞。本研究通过实验证实，KAT5与MDM2在肺腺癌中同时呈现高表达状态，二者主要表达于细胞质中。通过进一步统计分析 KAT5与 MDM2的相关性，结果提示在肺腺癌组织中KAT5与MDM2的阳性表达具有相关性，且呈正相关性，说明二者在肺腺癌的发生发展过程中可能起到相互促进作用。进一步推测，二者相互作用的可能的途径：一是KAT5通过介导MDM2 的乙酰化来增强表达，通过依赖或非依赖P53途径发挥促癌作用；二是通过MDM2介导KAT5的泛素化过程，参与肿瘤调控。KAT5存在与MDM2特异性结合的泛素化结合位点，二者同时高表达于肺腺癌组织，可能二者存在特异性调节失常并导致KAT5无法被MDM2正常泛素化降解，使KAT5蛋白表达水平上升导致乙酰化失衡，进而参与肺腺癌的发生和发展。综上所述，肺癌组织中 KAT5与 MDM2呈高表达。KAT5与MDM2阳性表达与肺腺癌患者的TNM分期、肿瘤分化和淋巴结转移，二者可能协同促进肺腺癌的发生发展。但KAT5与MDM2在肺腺癌发生发展中的具体分子生物学机制仍需进一步深入研究，以便为肺腺癌的基因靶向治疗提供新的理论依据。参考文献：1SUSTER D I，MINO-KENUDSON M.Molecular pathology of primary non-small cell lung cancerJ.Arch Med Res，2020，51（8）：784-798.2戎银芳，赵玲娜，宗刚军，等.MMP3在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义 J.重庆医学，2021，50（23）：4024-4027.3YANG Y，SUN J，CHEN T，et al.Tat-interactive Protein-60KDA（TIP60）Regulates the Tumorigenesis of Lung Cancer In Vitro J.J Cancer，2017，8（12）：2277-2281.4艾明发，金燕，张子波.赖氨酸乙酰转移酶5与肿瘤 J.中国生物化学与分子生物学报，2022，38（8）：1023-1032.5WU A，TANG J，GUO Z，et al.Long Non-Coding RNA CRYBG3 Promotes Lung Cancer Metastasis via Activating the eEF1A1/MDM2/MTBP AxisJ.Int J Mol Sci，2021，22（6）：3211.6HOU H，SUN D，ZHANG X.The role of MDM2 amplification and overexpression in therapeutic resistance of malignant tumorsJ.Cancer Cell Int，2019，19（8）：216.7SIEGEL R L，MILLER K D，FUCHS H E，et al.Cancer Statistics，2021 J.CA Cancer J Clin，2021，71（1）：7-33.8郅程，袁忠民，赖妙玲等.口腔鳞状细胞癌中Tip60（KAT5）的表达及其相关性分析 J.中山大学学报（医学版），2020，41（1）：112-117.9VAN DEN BROECK A，NISSOU D，BRAMBILLA E，et al.Activation of a Tip60/E2F1/ERCC1 network in human lung adenocarcinoma cells exposed to cisplatin J.Carcinogenesis，2012，33（2）：320-325.10PATEL J H，DU Y，ARD P G，et al.The c-MYC oncoprotein is a substrate of the acetyltransferases hGCN5/PCAF and TIP60 J.Mol Cell Bio，2004，24（24）：10826-10834.11LIEBL M C，HOFMANN T G.The role of p53 signaling in colorectal cancer J.Cancers（Basel），2021，13（9）：2125.12WANG H，LU Y，WANG M，et al.Roles of E3 ubiquitin ligases in gastric cancer carcinogenesis and their effects on cisplatin resistance J.J Mol Med（Berl），2021，99（2）：193-212.13WANG W，QIN J J，RAJAEI M，et al.Targeting MDM2 for novel molecular therapy：Beyond oncology J.Med Res Rev，2020，40（3）：856-880.14ENDO S，YAMATO K，HIRAI S，et al.Potent in vitro and in vivo antitumor effects of MDM2 inhibitor nutlin-3 in gastric cancer cells J.Cancer Sci，2011，102（3）：605-613.15NING Y，HUI N，QING B，et al.ZCCHC10 suppresses lung cancer progression and cisplatin resistance by attenuating MDM2-mediated p53 ubiquitination and degradationJ.Cell Death Dis，2019，10（6）：414.16DOHMESEN C，KOEPPEL M，DOBBELSTEIN M.Specific inhibition of Mdm2-mediated neddylation by Tip60J.Cell Cycle，2008，7（2）：222-231.17DENG M，ZHANG L，ZHENG W，et al Helicobacter pylori-induced NAT10 stabilizes MDM2 mRNA via RNA acetylation to facilitate gastric cancer progressionJ.J Exp Clin Cancer Res，2023，42（1）：9.（收稿日期：2023-06-28）24