肺岩宁下调转录因子Snail表达抑制人肺腺癌A549细胞EMT发生及侵袭转移.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一：基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究肺岩宁下调转录因子Snail表达抑制人肺腺癌A549细胞EMT发生及侵袭转移张亚辉，蔡玥娇，邓海滨，王中奇，徐振晔（上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）摘要：目的研究肺岩宁抑制人肺腺癌A549细胞侵袭转移的分子机制。方法体外培养A549细胞，细胞计数试剂盒（Cell counting kit 8，CCK-8）检测不同浓度的肺岩宁对A549细胞生长增殖的影响；细胞形态学观察和免疫印迹实验（Western blot）检测转化生长因子1（Transforming growth factor-1，TGF-1）对A549细胞上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation，EMT）发生的影响；Western blot、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）实验检测TGF-1诱导前后，肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋白及mRNA表达变化；划痕实验、Transwell实验检测TGF-1诱导前后，肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的影响变化；构建稳定过表达Snail的A549细胞株，Western blot、RT-qPCR实验检测稳定过表达锌指转录因子（Snail）后，肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋白及mRNA表达变化；划痕实验、Transwell实验检测稳定过表达Snail后，肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的影响变化。结果不同浓度的肺岩宁处理后，A549细胞的生长受到不同程度的抑制（P0.01）；10 ngmL-1的TGF-1可以诱导A549细胞EMT发生；与对照组比较，TGF-1诱导后，A549细胞侵袭迁移能力增加（P0.01），而与TGF-1组比较，肺岩宁能够抑制A549细胞的侵袭迁移能力（P0.01）、上调A549细胞中E钙黏蛋白（E-cadherin）及E-cadherin mRNA的表达（P0.01），下调N钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和Snail及其mRNA的表达（P0.05），抑制A549细胞EMT发生；与TGF-1诱导组比较，稳定过表达Snail能够减弱肺岩宁对A549细胞的侵袭转移能力的抑制作用（P0.01）、减弱肺岩宁对A549细胞中E-cadherin及其mRNA表达的上调作用（P0.01）、N-cadherin、Snail（P0.05）和及其mRNA表达的下调作用。结论肺岩宁方可能通过下调转录因子Snail的表达抑制A549细胞EMT发生及其侵袭转移。关键词：肺岩宁方 肺癌 EMT 侵袭转移 Snaildoi:10.11842/wst.20210921003 中图分类号:R285.5 文献标识码:A癌症是21世纪人类在医学领域面临的重大挑战之一，相较于其它恶性肿瘤，发病数量的增加是肺癌成为肿瘤所致死亡的重要原因1-2。肺癌早期的咳嗽、胸痛、血痰等临床症状不具有特异性，不能引起患者足够重视，部分患者就诊时已是晚期，失去最佳治疗时间，预后较差3-4。EMT是指上皮表型细胞向间充质表型细胞转变的一种可逆分子生物学过程，除了参与胚胎形成、器官发育和组织形成外，也参与了肿瘤的发生和转移，促进肿瘤细胞侵袭和运动，是近10余年来肿瘤转移研究的热点5-6。EMT现象发生的过程中，除细胞形态会发生改变外，相关分子标志物也随着发生相应的变化。在一些细胞因子诱导后，细胞形态会 收稿日期：2021-09-21 修回日期：2021-12-30 上海市教育委员会科研创新计划重大项目（NO.2017-01-07-00-10-E00064）：源于精气理论的肺岩宁方抗肺癌生长与转移作用机制的研究；负责人：邓海滨。通讯作者：邓海滨，主任医师，主要研究方向：中医及中西医结合肿瘤临床与实验研究。1239 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 逐渐失去上皮样表型，由紧密连接的铺路石样向分散的纤维梭形样变化，上皮样标志蛋白E-cadherin表达会逐渐减少或者不表达。大量研究发现，中药的有效活性成分能够抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和转移，诱导肺癌细胞凋亡，阻断肺癌发生发展过程中关键的的调控基因和信号通路等，在体内外展示出了良好的抗肺癌效果7。肺岩宁是上海市名老中医徐振晔教授基于精气理论总结出的经验方，具有多靶点抗肺癌生长转移的作用，已获得国家专利（201010022885.7）。徐振晔教授认为肿瘤发病是全身性疾病在局部的表现，致病因素繁杂，是内外因综合作用的结果，“体质内虚”存在于肿瘤发病过程的始终。对于肺癌，徐教授认为肺癌的病因病机主要是精气亏虚、邪毒积聚所致的阴阳失调，以“益气养精、解毒散结”为治疗大法，临床采用肺岩宁方化裁治疗肺癌患者8。前期实验表明，肺岩宁治疗肺癌具有改善患者临床症状、提高机体调节血清免疫细胞亚群的能力9。本研究在“益气养精、解毒散结”的精气理论指导下，以人肺腺癌 A549 细胞为研究对象，观察肺岩宁对TGF-1诱导的A549细胞EMT发生和侵袭转移能力的影响；构建稳定过表达Snail的A549细胞，研究肺岩宁对稳定过表达Snail的A549细胞EMT发生和侵袭转移能力的影响，明确Snail在肺岩宁对A549细胞EMT发生和侵袭转移能力影响中的作用，初步探讨了肺岩宁抑制肺癌侵袭转移的分子机制。1 主要材料 人肺腺癌 A549细胞，购于上海富衡生物科技有限公司；肺岩宁颗粒剂处方：生黄芪40 g、黄精30 g、石见穿30 g、山慈菇15 g、蜂房9 g、干蟾皮9 g等。肺岩宁颗粒由上海万仕诚药业有限公司提供。药物母液使用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）溶解，0.22 m微孔过滤器过滤，保存在-20冰箱里，临用时以RPMI 1640培养基稀释。RPMI1640培养基、胰蛋白酶消化液、PBS缓冲液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（BI 公司）；青链霉素双抗（美国 Gibco 公司）；TGF-1（上海达科为生物）；CCK-8试剂（日本同仁化学）；RIPA 裂解液（上海威奥生物）；Matrigel基质胶、Transwell小室（美国Corning公司）；结晶紫染色液（上海 碧 云 天 生 物）；Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH 及 Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody均购于美国CST公司；反转录试剂盒、PCR试剂盒（南京诺唯赞生物）。2 方法 2.1细胞培养人肺腺癌细胞A549用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI1640完全培养基，常规培养在37、5%CO2的细胞培养箱中。显微镜下观察，待细胞贴满皿底时用0.25%胰蛋白酶消化传代。2.2CCK-8 法检测肺岩宁对 A549 细胞生长增殖的影响取对数生长期的A549细胞消化，用RPMI1640完全培养基制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至每毫升4104个，毎孔100 L接种于96孔培养板中，于37、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。细胞贴壁后分别加入浓度为 0.25，0.5，1，2，4，8 mgmL-1的肺岩宁，对照组加入等体积无血清培养基。培养 24 h 后，加入10 L CCK-8试剂，震荡混匀，孵育2 h，酶标仪450 nm波长下检测其吸光度值，并计算细胞存活率。2.3转化生长因子TGF-1诱导A549细胞EMT发生将细胞随机分为空白对照组和 TGF-1（2.5、5、10 ngmL-1）处理组，空白对照组加入等体积无血清培养基。24 h后显微镜下观察各组A549细胞形态变化并拍照；提取各组细胞蛋白，Western blot检测EMT相关标志蛋白表达。2.4肺岩宁对TGF-1诱导前后的A549细胞EMT标志蛋白及mRNA表达的影响分别设置空白对照组、TGF-1组和不同浓度肺岩宁处理组。空白对照组加入等体积无血清培养基；TGF-1组加入含10 ngmL-1 TGF-1的无血清培养基；肺岩宁处理组分别加入含浓度为0.25，0.5，1 mgmL-1的肺岩宁预处理1 h后，加入含10 ngmL-1 TGF-1的无血清培养基继续培养。24 h 后显微镜下观察各组A549 细胞形态变化并拍照。提取各组细胞蛋白，Western blot检测EMT相关标志蛋白表达；提取细胞总RNA，检测各组细胞EMT相关mRNA表达。2.4.1Western blot检测EMT相关标志蛋白表达变化加入 RIPA裂解液冰上裂解并收集各组细胞，离心后取上清，二奎琳甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法测定细胞蛋白浓度以确定上样量。制胶，上样，电泳，1240 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一：基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究湿转法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4孵育过 夜，二 抗 室 温 孵 育 1 h，化 学 发 光 试 剂（Electro chemiluminescence，ECL）法曝光显影。2.4.2RT-qPCR检测EMT相关mRNA表达变化实验所需引物设计及合成由上海铂尚生物技术有限公司完成（表1）。加入Trizol收集各组细胞，提取细胞总RNA测定浓度，按照试剂盒说明书标准操作，经过逆转录成为 cDNA，PCR 法扩增 E-cadhrein、N-cadhrein、Vimentin、Snail等mRNA，-actin mRNA为内参对照。反应条件为：95 30 s，1 个循环预变性；95 10 s，60 30 s，40 个循环进行循环反应；95 15 s，60 60 s，95 15 s，1个循环采集融解曲线。2.5肺岩宁对TGF-1诱导前后的A549细胞侵袭和迁移能力的影响2.5.1划痕实验检测细胞迁移能力变化划痕实验分组同“2.4”。常规培养细胞，调整细胞浓度至每毫升3105个，接种到6孔板中。细胞贴壁后取6孔板，持灭菌吸头，垂直于6孔板平面划痕。PBS洗3次，对各组细胞拍照。24 h后显微镜下观察各组细胞划痕修复情况并拍照，计算划痕修复率。2.5.2Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力变化Transwell实验分组同“2.4”。用无血清培养基5 1稀 释 Matrigel 胶 混 匀，取 稀 释 液 40 L 均 匀 铺 于Transwell小室的上室，置于生物安全柜内过夜。实验前加入30 L无血清培养基于37、5%CO2培养箱中水化基底膜30 min。取对数生长期细胞，调整细胞浓度至每毫升5105个，毎孔200 L接种于Transwell小室的上室，下室中加入 500 L含 10 ngmL-1 TGF-1和20%FBS的RPMI 1640培养液。培养24 h后，取出Transwell小室，PBS 洗 2遍，棉签拭去上室细胞。4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色30 min，PBS洗2遍，晾干。200倍光镜下计数不同视野的穿膜细胞数，计算各组细胞侵袭率。迁移实验不铺Matrigel胶，其余操作及处理同侵袭实验。2.6构建稳定过表达Snail的A549细胞株根据 NCBI人 Snail基因编码设计合成引物，PCR法扩增获取Snail基因片段。将BamHI、AgeI双酶切后的Snail片段与GV492载体进行重组反应，利用基因测序和PCR检测共同鉴定重组质粒。慢病毒包装系统中的质粒共转染 293T 细胞，将包装好的慢载体 LV-Snail离心浓缩，荧光显镜下观察病毒存活数目，采用稀释计数法测定其滴度。制备的慢病毒载体感染A549细胞后筛选稳定转染Snail的细胞株，细胞分为阴 性 对 照（Negative control，NC）组 和 过 表 达（Over express）组荧光显微镜下观察、RT-qPCR 及 Western blot共同检验细胞转染及筛选效果。2.7肺岩宁对稳定过表达 Snail后的 A549细胞 EMT标志蛋白及mRNA表达的影响将细胞分为 NC+TGF-1 组、NC+TGF-1+FYN组、OE+TGF-1组和OE+TGF-1+FYN组。收集细胞后，提取各组细胞蛋白和细胞总RNA，实验方法同前。2.8肺岩宁对稳定过表达 Snail 后的A549细胞侵袭和迁移能力的影响实验分组及方法同前。2.9统计分析实验中数据均采用SPSS 24.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 7.0作图。计量资料用平均值标准差（x s）表示，多组间比较使用单因素方差分析，多组与对照组比较采用新复极差法（Dunnett s T）检验。样本不符合正态性检验时，采用非参数检验统计。当 P0.05时表示有统计学差异，P 0.05）；当肺岩宁浓度为1 mgmL-1时，细胞的增殖受到表1引物序列基因Homo-E-Cadherin(CDH1)-178Homo-vimentin(VIM)-98Homo-N-cadherin(CDH2)-76Homo-SNAI1(SNAIL)-70Homo-actin-250引物序列（5 3）F：AGTACAACGACCCAACCCAAR：AGTACAACGACCCAACCCAAF：GGCTGTGCCTTCCTACAGACR：AGTGGGTATCAACCAGAGGGAF：TCCTGCTTATCCTTGTGCTGAR：AAAAGTTGTTTGGCCTGGCGF：GACCCCAATCGGAAGCCTAAR：AGGGCTGCTGGAAGGTAAACF：CATGTACGTTGCTATCCAGGCR：CTCCTTAATGTCACGCACGAT1241 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 抑制（P0.05）。肺岩宁的后续实验浓度选用为0.25、0.5、1 mgmL-1三个浓度（见图1）。3.2转化生长因子TGF-1诱导A549细胞EMT发生显微镜下观察 A549细胞，发现细胞间连接较紧密且呈铺路石形上皮样表型。经过浓度为 2.5，5，10 ngmL-1的TGF-1干预24 h后，细胞形态由紧密连接的铺路石形上皮样细胞转变成为呈分散的纤维梭形的间质样细胞，且当 TGF-1 的浓度为 10 ngmL-1时，细胞的形态变化最显著（图2）。进一步采用 Western blot 实验检测 TGF-1 诱导后，各组细胞EMT相关标志蛋白表达变化。结果显示（图3），A549细胞中上皮标志物E-cadherin的表达随着TGF-1浓度的升高而减弱（P0.01）；间质标志蛋白 N-cadherin 表达随着 TGF-1 的浓度升高而增加（P0.05），但随着TGF-1浓度的升高而增加（P0.01）；转录因子Snail的表达随着TGF-1的浓度升高而明显增加（P0.01）；以上蛋白表达变化均在TGF-1的浓度为10 ngmL-1时最显著。上述结果提示：A549细胞经过TGF-1诱导后可发生EMT。后续的实验中，选用浓度为10 ngmL-1的TGF-1诱导A549细胞24 h来构建肺癌EMT的细胞模型。3.3肺岩宁对A549细胞形态变化的影响通过观察各组细胞形态变化发现，与TGF-1组比较，肺岩宁干预后细胞形态逐渐由分散的纤维梭形恢复成规则的铺路石样（图4）。3.4肺岩宁对TGF-1诱导的A549细胞EMT发生的影响Western blot实验检测肺岩宁干预后EMT相关标志蛋白表达变化（图5）。结果显示，E-cadherin表达上调（P0.01），N-cadherin、Vimentin和Snail的表达下调图2TGF-1诱导A549细胞24 h后细胞形态变化（100 x）图3TGF-1诱导A549细胞后EMT标志蛋白表达变化注：与对照组比，*P0.05，*P0.01。图1肺岩宁对A549细胞生长增殖的影响注：与对照组比，*P0.05，*P0.01。1242 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一：基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究（P0.05）。提示肺岩宁能够在蛋白水平上抑制A549细胞EMT的发生。我们进一步使用RT-qPCR实验检测了肺岩宁干预后，各组细胞 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和Snail的mRNA表达水平（图6）。与对照组比较，TGF-1组 E-cadherin mRNA 表达下调（P0.01），N-cadherin、Snail mRNA 表达上调，均具有统计学意义（P0.05）。与TGF-1 组比较，TGF-1+FYN 组 E-cadherin mRNA表达上调（P0.01），N-cadherin、Vimentin 和 Snail 的mRNA表达上调（均P0.05），提示肺岩宁在基因水平上同样能够抑制A549细胞EMT的发生。3.5肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的影响通常情况下，肿瘤细胞的侵袭迁移能力能够随着EMT 的进展而增强。我们进一步采用划痕实验、Transwell实验来研究肺岩宁干预后A549细胞侵袭迁移能力的变化。结果（图 7）显示，与对照组比较，TGF-1组划痕修复率明显增加，细胞侵袭迁移到膜下的细胞数目明显增多（P0.01），提示 10 ngmL-1 TGF-1诱导A549细胞后，细胞侵袭和迁移能力明显增强。与TGF-1组比较，给予不同浓度的肺岩宁处理后，细胞划痕修复率明显减小，侵袭和迁移数目明显减少（P0.01），提示TGF-1诱导的A549细胞的侵袭和迁移能力能够被肺岩宁显著抑制。3.6慢病毒载体LV-Snail介导的稳定转染A549细胞株构建利用慢病毒载体 LV-Snail 和慢病毒空载体 LV-GFP-Puro 分别转染 A549 细胞。在显微镜下可以看到，转染后细胞带有绿色荧光，成功获得稳定转染细胞株。Western blot 结果显示 OE 组细胞 Snail表达量图4FYN抑制TGF-1诱导的A549细胞EMT发生的形态变化图5FYN抑制TGF-1诱导的A549细胞EMT发生标志蛋白表达变化图6FYN抑制TGF-1诱导的A549细胞EMT发生mRNA表达变化注：与对照组比，*P0.05，*P0.01；与TGF-1相比，#P0.05，#P0.01。1243 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 蛋白高于NC组；RT-qPCR检测结果显示，OE组细胞Snail基因表达丰度是NC组的13.768倍，表明LV-Snail介导的稳定转染A549细胞株构建成功（图8-10）。3.7肺岩宁对稳定过表达 Snail的A549细胞EMT发生的影响为了探索转录因子Snail在肺岩宁抑制A549细胞EMT发生中的作用，用Western blot检测NC+TGF-1组、NC+TGF-1+FYN组、OE+TGF-1组和OE+TGF-1+FYN组细胞中EMT相关标志蛋白表达变化（肺岩宁浓度为0.25 mg、0.5 mg时，即对A549细胞EMT的发生及侵袭转移起到有效的抑制作用。考虑到药物的细胞毒作用，本部分实验的药物浓度为 0.5 mg/ml）。结果显示（图 11），与 NC+TGF-1组、OE+TGF-1组比较，NC+TGF-1+FYN 组和 OE+TGF-1+FYN 组的E-cadherin 表达显著上调（P0.01），N-cadherin 表达下调（P0.05），转录因子 Snail 的表达也显著下调（P0.01）；与 NC+TGF-1+FYN组比较，OE+TGF-1+FYN组细胞中E-cadherin表达减弱（P0.01），N-cadherin和Vimentin表达增强（P0.05），转录因子 Snail 的表达也显著增强（P0.01）。提示我们，Snail基因的过表达在蛋白水平上减弱了肺岩宁对A549细胞EMT发生的抑制作用。我们进一步采用RT-qPCR实验检测NC+TGF-1组、NC+TGF-1+FYN组、OE+TGF-1组和OE+TGF-图7划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭能力变化注：与对照组比，*P0.05，*P0.01；与TGF-1相比，#P0.05，#P0.01。1244 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一：基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究1+FYN组四组细胞中EMT相关mRNA表达变化，在基因水平探索转录因子Snail在肺岩宁抑制A549细胞EMT发生中的作用。结果显示（图12），与NC+TGF-1 组、OE+TGF-1 组比较，肺岩宁显著上调了 NC+TGF-1+FYN组和OE+TGF-1+FYN组的E-cadherin mRNA 表达（P0.01），下调了 N-cadherin mRNA 的表达（P0.05），转录因子Snial mRNA的表达也被显著下调（P0.05）。与NC+TGF-1+FYN组比较，OE+TGF-1+FYN组E-cadherin mRNA 表达显著减弱（P0.01），N-cadherin mRNA表达增强（P0.05），转录因子Snail mRNA的表达也显著增强（P0.01）。提示我们，Snail基因的过表达在基因水平上减弱了肺岩宁对 A549 细胞 EMT 发生的抑制作用。3.8肺岩宁对稳定过表达 Snail的 A549细胞侵袭转移能力的影响采用划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验检测了NC+TGF-1组、NC+TGF-1+FYN组、OE+TGF-1组和 OE+TGF-1+FYN 组四组细胞侵袭和迁移能力的变化。结果显示（图13），与NC+TGF-1组、OE+TGF-1组比较，NC+TGF-1+FYN组和OE+TGF-1+FYN组细胞划痕修复率明显减小，侵袭到膜下数目明显减少，肺岩宁显著抑制了 NC+TGF-1+FYN 组和 OE+TGF-1+FYN组细胞的侵袭和迁移能力（P0.01）；与NC+TGF-1+FYN 组比较，OE+TGF-1+FYN 组细胞划痕修复率明显增大，侵袭到膜下数目明显增多，侵袭和迁移能力明显增强（P0.01）。提示转录因子Snail的过表达在一定程度上减弱了肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的抑制作用。图8荧光显微镜下观察转染及筛选效果注：b为明场视野，g为绿色荧光视野。图11Western blot检测肺岩宁对稳定过表达Snail A549细胞EMT发生的影响注：A：NC+TGF-1；B：NC+TGF-1+FYN；C：OE+TGF-1；D：OE+TGF-1+FYN；与对照组比，*P0.05，*P0.01；与其他组相比，#P0.05，#P0.01。图10稳定转染细胞株Snail蛋白的表达图9稳定转染细胞株Snail基因的表达1245 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 图12RT-qPCR检测肺岩宁对稳定过表达SnailA549细胞EMT发生的影响注：与对照组比，*P0.05，*P0.01；与其他组相比，#P0.05，#P0.01。图13划痕实验、Transwell侵袭和迁移检测肺岩宁对稳定过表达Snail A549细胞迁移能力的影响注：与对照组比，*P0.05，*P0.01；与其他组相比，#P0.05，#P0.01。1246 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一：基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究4 讨论 最新研究提示，转移是影响肺癌患者预后的重要因素，如何有效防治转移是改善患者预后情况和延长生存时间的关键问题10-11。中医药在防治肺癌方面强调“既病防变”和“治未病”的思想，结合中医整体观念和辩证论治特色，体现了“治病求本”的治疗理念，从根本上预防肺癌转移和进展12-13。黄帝内经 有曰：“有诸内者必形诸外，视其外应，则应知其病所”。肺癌病初体内症状已发但外象未显14，导致临床确诊时多数已发生转移。肺癌转移的机制并不是单一和孤立的，各种机制之间相互联系、相互影响。EMT是引起肺癌发生转移的一个主要因素，调控了多个机制促进肺癌转移。比如HIF-1既能通过诱导EMT发生，又能通过调控相关转录因子促进肿瘤血管生成，进而增强肺癌转移能力。中医药调控肺癌转移亦是一个多机制、多途径的过程，多种靶点相互交织，互相影响，中药单体或复方能够调控两种及两种以上的机制抑制肺癌转移。齐元富等15研究发现，芪贞固本方通过下调VEGF mRNA抑制肿瘤血管生成和促进 E-cadherin 蛋白表达逆转EMT抑制肺癌荷瘤小鼠转移。促进细胞运动、侵袭、形态转变等是EMT现象的特性，EMT的表型转化又是肺癌细胞发生转移的重要过程，EMT作为防治肺癌转移的热点一直在被广泛研究16。有研究表明，EMT不是一个简单的二元过程，从上皮状态到完全间质状态，需要经过多个中间过渡状态17。表观遗传调控着EMT导致的这种细胞可塑性，寻找特异性调控EMT中间状态的调节因子及靶点有助于明确EMT表观遗传调控的具体分子机制和研究 EMT 复杂的调控过程18-19。中医药干预EMT的研究广泛已涉及到生长因子、转录因子、相关基因、micro RNA、蛋白激酶以及细胞间连接蛋白等多个层面20。转录因子Snail处于信号通路级联反应的中心环节，在调控肿瘤的发生发展和转移中有着重要作用21。Snail表达具有特异性，且在癌组织中表达明显高于癌旁组织，在EMT过程的进展、免疫调节和维持肿瘤细胞干细胞特性中也发挥了一定作用22。Snail作为一种重要的EMT诱导转录因子，能够通过调控EMT促进肺癌转移23，以Snail为靶点研究其对EMT的调控作用能够为中医药干预肺癌转移提供新思路。上海市名老中医、上海中医药大学附属龙华医院终身教授徐振晔根据肺癌患者年龄发病特点和临床证候的改变，结合五行中“金水相生”理论和张景岳补肾学术思想提出了防治肺癌的精气理论。徐教授认为中医药治疗肺癌的特色和优势在于通过防治复发转移，提高患者生活质量和延长生存期。基于精气理论，徐教授创制了由生黄芪、白术、黄精、仙灵脾、蜂房、干蟾皮、山慈菇等组成的“益气养精、解毒散结”的肺岩宁方。前期已围绕组织、细胞、蛋白、mRNA等多层次进行研究，证实了肺岩宁方具有多靶点、多机制、多途径抗肺癌生长转移的作用24-33。在本次实验中，首先研究了不同浓度肺岩宁对A549细胞生长增殖的影响，筛选出了处理A549细胞的药物浓度；利用转化生长因子TGF-1诱导A549细胞发生EMT，建立了肺癌EMT的细胞模型。接下来我们用肺岩宁对TGF-1诱导的 A549 细胞加以干预，进一步探索肺岩宁对A549细胞EMT发生和侵袭转移能力的影响。我们特别观察了转录因子Snail在此过程中的变化。与对照组比较，TGF-1诱导后的A549细胞中Snail表达显著上调；与 TGF-1 组比较，肺岩宁干预后 A549 细胞Snail在蛋白水平和基因水平的表达均显著下调，且与E-cadherin 的表达相反。基于 Snail在此过程中表达变化如此显著，推测肺岩宁有可能通过下调转录因子Snail的表达来抑制A549细胞EMT发生及侵袭转移能力；构建稳定过表达Snail基因的A549细胞并给予肺岩宁干预，进一步探索中药复方肺岩宁对稳定过表达Snail的A549细胞EMT发生及侵袭转移能力的影响。结果发现，Snail基因的过表达在一定程度上阻碍了肺岩宁对A549细胞EMT发生及侵袭转移能力的抑制作用，提示肺岩宁可能通过下调转录因子Snail的表达来抑制A549细胞EMT发生及侵袭转移。与以往研究相比，本次实验对肺岩宁抑制肺癌A549细胞EMT发生及侵袭转移的机制研究更深入，从蛋白表达、基因表达以及表型变化等多方面进一步发现了肺岩宁可能通过下调转录因子Snail抑制A549细胞EMT发生及侵袭转移，找到了“Snail”这一特异性调控EMT中间状态的靶点，有助于明确肺岩宁抑制肺癌侵袭转移的具体分子机制，亦丰富了中医药抑制肺癌侵袭转移的理论。本次实验提示我们，EMT的调控过程虽复杂，且中药复方抑制肺癌侵袭转移的具体机制难以明确，但随着中医药对EMT的研究深入到生长因子、转录因子、相关基因、micro RNA、蛋白激酶以及1247 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 细胞间连接蛋白等多个层面，一些特异性的靶点必将被慢慢发现、并得到验证。然而，就本次实验而言，肺岩宁如何下调转录因子Snail的表达仍需进一步研究；借助新的实验技术及药物的分析方法对肺岩宁的有效组分进行分析再优化组合，亦是课题组下一步的研究方向。参考文献 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