蛋白质印迹法 Western Blot技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Western blot 实验技术,2012.12.12,Western blot的定义,Western blot的基本原理,Western blot的一般流程,Western blot的常见问题,定义,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,Western blot又成蛋白质印迹法，对单项电泳后蛋白质分子的印迹分析称western印迹法，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,且能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。,基本原理,Western blot是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。,一般流程,蛋白质样品的制备,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,蛋白质样品的制备,从-20冰箱取出细胞液，室温溶解后，3000rpm离心5min，吸去上清液，保留细胞沉淀。每管加入一定量的上样缓冲液裂解细胞，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，煮沸10min，使蛋白变性，12000rpm离心5min，取上清，测蛋白含量，用的是TCA蛋白测定法测蛋白含量。,（,1）25mg/mL BSA的配制取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也以-20长期保存。,（2）1mg/mL BSA的配制:,取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用1,loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL，按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20。,（3）60%TCA工作液的配制:,取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水中，即为60%TCA工作液，使用前配制。,（4）配制BSA标准系列和样品 如表格：,BSA（g）,1mg/mL BSA(l),1loading buffer（l）,ddH2O（l）,TCA（l）,0,0,50,50,66.7,2.5,2.5,47.5,50,66.7,5,5,45,50,66.7,10,10,40,50,66.7,20,20,30,50,66.7,30,30,20,50,66.7,40,40,10,50,66.7,50,50,0,50,66.7,蛋白样品 5l，1loading buffer 45l，ddH2O 50l，TCA 66.7l，放置15-30min，用酶标仪，=595nm处测定蛋白含量。,SDS-PAGE电泳,基本原理：,在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。,蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。,因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。,当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。,电泳步骤：,1.清洗玻璃板,2.灌胶与上样,（1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶,（2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的23处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（30min）。,（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时，说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒去上层水，并用吸水纸将水吸干。,（4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好拔）。,(5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃板内侧）,（6）根据测出的蛋白含量，计算出含一定质量蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白变性，并12000rmin离心5min。,3.电泳,在浓缩胶中电压可为80V，至溴酚蓝进入分离胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘1cm处时停止电泳。,转 膜,1.转一张膜需要准备长8.0cm，宽5.5cm的六张滤纸和一张硝酸纤维素膜。（切滤纸和膜时要戴上手套，以免手上的蛋白会污染膜）将切好的滤纸和膜至于转移缓冲液中浸两小时才可使用。（使膜浮于转移缓冲液上，只有下层才与水接触，这样由于毛细血管作用才能把整个膜浸湿。）,2.将玻璃板撬开，去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻刮去，小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。（在撬玻璃板时要小心，因玻板易碎。剥离分离胶时要注意不要弄破分离胶）,3.放置顺序：,阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜-三层滤纸-海绵垫-阳极。（,顺序不能反了，膜盖上后不可移动，每盖一层，要用玻棒擀出其中的气泡。第二、三步时戴手套，因转移缓冲液中含甲醇，实验室要开门空气流通。）,4.把夹子放入转移槽中，黑面对对槽的黑面，白面对槽的红面，转移时会产热用冰块降温。一般150V，400mA转膜1：30h。,5.将膜晾干备用。,封闭,用5%的脱脂奶粉封闭液（2.5g脱脂奶粉，50mlPBST缓冲液）封闭，在摇床上封闭一小时。,一抗杂交,一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当浓度（一抗使用前要3000rmin离心3min）。,将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温下脱色摇床20min,4过夜。次日用PBST缓冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。,二抗杂交,用同样方法准备二抗稀释液（无叠氮钠）并与膜接触，室温下孵育1h。再用PBST缓冲液洗三次，每次5min,进行化学发光反应。,底物显色,（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。,（2）在暗室中，取出X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。,（3）曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，先显影液后定影液，显影定影时间依据说明书，最后用自来水冲去残留的定影液，室温晾干。,Western blot的常见问题,1.胶不平：,原因：1.1玻板洗刷不干净。,1.2 加入合适的TEMED后未充分混匀，导致部分胶块聚合不均匀。,2.在灌胶时 应沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡，加水液封时要慢，否则胶会冲变型。,3.拔梳子时应垂直向上拔起，用力均匀。,4.微笑或倒微笑,原因:胶板底部有气泡，会影响电泳效果，应赶走气泡，采用的方法是预电泳55V,半小时。,5.凝胶肿胀或卷曲,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min.,6.在转膜过程中会产热，因为缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。所以应放置冰块降温。,7.背景太深：,原因：7.1 膜没有充分浸湿,7.2膜或缓冲液污染,7.3封闭液封闭不完全,7.4 抗体浓度过高,