培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种细胞外多糖的平衡_37页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,培养条件决定由戊糖乳杆菌,LPS26,生产的两种细胞外多糖的平衡,Jorge-Ignacio Sanchez,1 Beatriz Martnez,1 Rafael Guillen,2,Rufino,Jimenez-Daz,2 and Ana Rodrguez1*,摘要,从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌,LPS26,，可以生产一类由两种胞外多糖,(EPS),组成的荚膜多聚物：,EPS A,，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（,3,：,1,）组成；,EPS B,，一种低分子量胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（,3,：,1,）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）的化学半限定培养基及温度和,pH,影响的分析表明培养基的条件对于由菌株,LPS26,生产的,EPS,的类型和浓度有很明显的影响。这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产,EPS,的报道。,前言,微生物胞外多糖（,EPS,）是一类范围广泛的分泌多聚物，既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳定剂应用于食品方面。由于乳酸细菌（,LAB,）是食品级的，因此它生产的,EPS,引起了人们越来越多的兴趣。,LAB,生产的,EPS,可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由几种单体构成（杂多糖）。由不同菌株生产的,EPS,在糖成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。,前言,迄今为止，这些,EPS,作为生物组分在食品工业上的使用很大程度上受到了,LAB,低产量（,40,到,600mg L,-1,）的限制。因此，高效地由,LAB,生产,EPS,的条件应该被优化。,近年来由乳酸杆菌生产,EPS,已被报道。但迄今为止还没有关于由戊糖乳杆菌生产,EPS,的特点的报道。对此，我们研究了由戊糖乳杆菌,LPS26,生产的两种不同的,EPS,。根据我们的结果，两种,EPS,的比率可以被调节并且产物水平可通过培养条件而被优化。,材料和方法,菌株和培养基条件,对细胞表面进行化学处理,EPS,的分离纯化,EPS,的定量,单糖的分析,发酵条件,动力学参数,以牛奶进行培养,统计学分析,1,菌株和培养基条件,戊糖乳酸杆菌,LPS26,（,L.,pentosus,LPS26,）,乳酸乳球菌乳酸亚种,IPLA947,（,Lactococcus,lactis,subsp.,lactis,IPLA947,）,可在优化的半合成培养基,SDM,中培养获得细胞外多糖（,EPS,）,培养基组成：吐温,80,（,Tween,80,）,1g/L,柠檬酸铵,2g/L,乙酸钠,5g/L,MgSO,4,7H,2,O 0.1g/L,MnSO,4,0.05g/L,K,2,HPO,4,2g/L,酵母浸粉,5g/L,蛋白胨,10g/L,pH 6.0,为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。,2,对细胞表面进行化学处理,每,10ml,样品过夜培养后以,5ml,以下任何一种溶液重悬处理：,30,质量分数的十二烷基磺酸钠于,45C,下处理,30min,0.05M,NaOH,于,20C,处理,30min,蛋白酶,K,（,1.5mg/ml,）于,50C,处理,30min,3,EPS,的分离纯化,在前人方法上进行改进如下：,10ml,样品以,30W 1Hz,超声波处理了,10min,用,10,质量分数的三氯乙酸搅拌处理,30,分钟,410000g,离心,10min,以去除细胞核蛋白,以,2,倍体积的酒精沉淀过夜，重溶于,1ml,蒸馏水中,4,中透析,48h,，期间每,12h,换水一次,纯净的,EPS,被冻干以便于进行进一步定量和成分分析,4,EPS,的定量,对含,EPS,的样品进行高压液相色谱,(HPLC),系统进行过滤层析,(SEC),，组分用一个以,TSK-Gel,precolumn,柱保护的,TSK-Gel G5000 PWXL,柱收集。,HPLC,条件如下：,流动相是,0.1M,的,NaNO,3,柱温是,40,流速是,0.6ml/min,进样量是,50ul,5,单糖的,分析,存在两种,EPS(EPS A and EPS B),分离得到的,EPS,蒸馏水透析,48h,以去除来自流动相的,NaNO3,然后将其冻干,依靠根据,alditol,acetate,方法进行的气相色谱来测定多糖成分,样品以丙酮（,1ul,对应每,ug,EPS,）溶解,通过与,Hewlett-Packard 5972,选择性质量检测器连接的,Series II Hewlett-Packard 5890,仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（,0.25 mm by 30 m;SPTM 2330,）进行分析,烤箱的温度保持在,220,6,发酵条件,所有的发酵实验都是在一个,750ml,的含葡萄糖（,20g/L,）的,SDM,培养基中进行的,以,30C,过夜培养的培养物按,2,体积分数接种,通过一个,InPro,3000/225,探针进行测量后自动补加,5.7N,的,NH,4,OH,来控制,pH,转速为,150rpm,当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀释度下进行发酵,分别对多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度（,5,，,20,，,30,和,40g/L,），不同温度（,20,，,25,和,30C,）以及不同,pH,水平（,6.0,，,5.0,和不进行控制）进行了实验,对细菌的生长情况（以,CUF/ml,表示），,pH,（未控制,pH,培养物）和产物,EPS,的量进行了测定，,HPLC,对糖和有机酸进行检测,7,动力学参数,最大生长率,max,ln,（,X1-X0,）,/t1,t0,）,，其中,X1,和,X0,是,CFU/ml,的数，,t0,和,t1,是对数生长期起止时间,EPS,产率,(YEPS),以每克糖产生的,EPS,毫克数表示,单位体积产率,(,Pv,),以每小时每升培养液中产生的,EPS,毫克数表示,8,以牛奶进行培养,在商品,UHT,培养基添加了,2,的脱脂乳糖粉末作为两种菌的培养基,两种菌分别在,MRS,和,M17,培养基上过夜培养，以它们作为接种体在,25C,下培养,72,小时后每毫升戊糖乳酸杆菌,LPS26,长出了,210,7,个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种,IPLA947,则长出了,7.510,6,个,9,统计学分析,数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小,差异意义监测分析验证（,P0.01,）,材料和方法,乳酸乳球菌乳酸亚种,IPLA947,（,Lactococcus lactis,subsp.,Lactis,IPLA947,）,1.,菌株和培养基条件,戊糖乳酸杆菌,LPS26,（,L.pentosus,LPS26,）,材料和方法,这两种菌株可在优化的半合成培养基,SDM,中培养获得细胞外多糖（,EPS,）,培养基组成：吐温,80,（,Tween 80,）,1g/L,柠檬酸铵,2g/L,乙酸钠,5g/L,MgSO,4,7H,2,O 0.1g/L,MnSO,4,0.05g/L,K2HPO,4,2g/L,酵母浸粉,5g/L,蛋白胨10g/L,pH 6.0,为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。,1.,菌株和培养基条件,材料和方法,2.,对细胞表面进行化学处理,每,10ml,样品过夜培养后以,5ml,以下任何一种溶液重悬处理：,30,质量分数的十二烷基磺酸钠于,45C,下处理,30min,0.05M NaOH,于,20C,处理,30min,蛋白酶,K,（,1.5mg/ml,）于,50C,处理,30min,材料和方法,3.EPS,的分离纯化,在前人方法上进行改进如下：,10ml,样品以,30W 1Hz,超声波处理了,10min,用,10,质量分数的三氯乙酸搅拌处理,30,分钟,410000g,离心,10min,以去除细胞核蛋白,以,2,倍体积的酒精沉淀过夜，重溶于,1ml,蒸馏水中,4,中透析,48h,，期间每,12h,换水一次,纯净的,EPS,被冻干以便于进行进一步定量和成分分析,材料和方法,4.EPS,的定量,对含,EPS,的样品进行高压液相色谱,(HPLC),系统进行过滤层析,(SEC),，组分用一个以,TSK-Gel precolumn,柱保护的,TSK-Gel G5000 PWXL,柱收集。,HPLC,条件如下：,流动相是,0.1M,的,NaNO3,柱温是,40,流速是,0.6ml/min,进样量是,50ul,材料和方法,5.,单糖的分析,存在两种,EPS(EPS A and EPS B),分离得到的,EPS,蒸馏水透析,48h,以去除来自流动相的,NaNO3,然后将其冻干,依靠根据,alditol acetate,方法进行的气相色谱来测定多糖成分,样品以丙酮（,1ul,对应每,ug EPS,）溶解,通过与,Hewlett-Packard 5972,选择性质量检测器连接的,Series II Hewlett-Packard 5890,仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（,0.25 mm by 30 m;SPTM 2330,）进行分析,烤箱的温度保持在,220,材料和方法,6.,发酵条件,所有的发酵实验都是在一个,750ml,的含葡萄糖（,20g/L,）的,SDM,培养基中进行的以,30C,过夜培养的培养物按,2,体积分数接种,通过一个,InPro 3000/225,探针进行测量后自动补加,5.7N,的,NH4OH,来控制,pH,转速为,150rpm,连续发酵,：当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀释度下进行发酵,分别对,多种碳源,（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），,不同糖浓度,（,5,，,20,，,30,和,40g/L,），,不同温度,（,20,，,25,和,30C,）以及,不同,pH,水平（,6.0,，,5.0,和不进行控制）进行了实验,对细菌的生长情况（以,CUF/ml,表示），,pH,（未控制,pH,培养物）和产物,EPS,的量进行了测定，HPLC,对糖和有机酸进行检测,材料和方法,7.,动力学参数,最大生长率,max,ln,（,X1-X0,）,/,（,t1,t0,）,，其中,X1,和,X0,是,CFU/ml,的数，,t0,和,t1,是对数生长期起止时间,EPS,产率,(YEPS),以每克糖产生的,EPS,毫克数表示,单位体积产率,(Pv),以每小时每升培养液中产生的,EPS,毫克数表示,材料和方法,8.,以牛奶进行培养,在商品,UHT,培养基添加了,2,的脱脂牛奶粉末作为两种菌的培养基,两种菌分别在,MRS,和,M17,培养基上过夜培养，以它们作为接种体。在,25C,下培养,72,小时后每毫升戊糖乳酸杆菌,LPS26,长出了210,7,个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种,IPLA947,则长出了,7.510,6,个,材料和方法,9.,统计学分析,数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测分析验证,结论为极为显著（,P0.01,）,图1.高压液相色谱分析,L.pentosus,LPS26产生的EPS,分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子量（high-Mw）多聚物（EPS A），分子量1.910,6,Da，另一种小分子量多聚物（EPS B)，分子量3.310,4,Da。,实验结果,EPS,的组成,气相色谱-质谱分析显示两种EPS的单糖组成是不同的。EPS A由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近似为3：1，然而EPS B由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。,实验结果,EPS A&B,组成,甘露醇和果糖分别提供了最高,（黄）,和最低,（,绿,）,的活菌数，但是甘露醇和葡萄糖之间没有检测到明显的差别。,果糖和甘露醇导致较低的EPS合成,，,然而葡萄糖和乳糖则是更适合EPS产生的糖源。,EPS,A,似乎比EPS,B,更依赖于特定碳源,用甘露醇，葡萄糖和乳糖发酵得到的EPS A占有更高的比率。但是，用果糖发酵则得到相反的比率。,用不同碳源发酵，两种EPS的单糖组成的差异都很小,。,实验结果碳源的影响,随着糖源浓度增加，活菌数增多。,EPS随着初始葡萄糖浓度的增加,而,增加,。,葡萄糖浓度在,5,克每升时EPS,产量最大，,20,40,g/L时,，EPS产量持在很窄的范围内,，且,EPS A和EPS B的比率不,受葡萄糖浓度的影响,。,实验结果糖浓度的影响,温度影响两种EPS的产量，从EPS A的产量可以看出温度与EPS的产量呈负相关性,。,20的总多聚物量是25条件下的1.2倍、是30条件下的1.6倍。20条件下的EPS产量也比25和30条件下的多。,相反的，通过20和25的显著不同可以得出低温降低活菌数。,实验结果温度的影响,对pH进行调节可提高两种EPS的产量，而且EPS B的效果尤为明显。,pH5.0时可检测出更多的活菌数,。,EPS产量,在,pH,6,.0 时明显高于 pH,5,0 和不调节 pH的两组,。,实验结果,pH,的影响,根据不同温度和不同pH条件下的实验，确定了一个适合L.pentosus LPS26的生长条件用于生产EPS。L.pentosus LPS26培养于SDM中，,葡萄糖含量30g/L,，,pH6.0，20,培养,。我们可以确定总EPS的产量为511mg/L,。,实验结果最优培养条件,在D0.02 h,-1,时得到最大的EPS A产量，而更高的稀释度会导致产量显著下降,。,从0.02到0.07 h,-1,的稀释度范围内，只得到很少的EPS B（50mg每升），因此，EPS B的产量似乎不受生长率的影响。,极稀的稀释度下（0.02到0.04 h,1,），葡萄糖消耗量和乳酸盐的生成量相似。在更高的D值（0.07到0.11 h,-1,）下，残留的葡萄糖增多，而乳酸盐浓度降低。,在D0.02 h,-1,时，EPS产量最大（18.9mgEPS,/,g葡萄糖）,，,单位体积产率,Pv,最大（7.08mgL,1,h,1,）。,实验结果连续培养的影响,在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对LPS26和酸化的L.lactis进行联合培养。在牛奶培养基中，EPS产量很低，,但,主要产生的是EPS B,。,对牛奶培养基进行补充后，不仅微生物量有了明显的增加（LPS26 2.510,8,CFU ml,-1,和IPLA947 1.810,9,CFU ml,-1,）而且EPS B有了极大的增长，所以EPS总产量也有了明显的增长（162.9mg/L）,实验结果牛奶培养基的影响,我们的结果显示培养条件对,L.pentosus,的生长和产生,EPS,有明显的影响，并能够证明用分批发酵时,EPS,产量高达,511mg/L,。,碳源对,L.pentosus,LPS26,的生长和产生,EPS,的量以及两种,EPS,的比率有明显的影响。葡萄糖提供,EPS,的高产量而且明显更支持,EPS A,的合成。相反，果糖更利于,EPS B,的合成。,L.pentosus,LPS26,的生长和,EPS,的产生无直接联系，因为最大活菌数量与,EPS,的最大产量并不相符。,最低糖浓度时葡萄糖的单位产,EPS,量是最高的，糖原的过量并不能刺激,EPS,的合成，只会降低合成的效率。,分析讨论,4.,较低温度时,EPS A,和,EPS B,的产量会增加，这是产,EPS,嗜温乳酸杆菌的共有特征。认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的细胞壁复合物的生物合成，会有更多的脂质运载体的前体分子在,EPS,的合成中被利用。,pH,值的控制同样可增强,L.pentosus,LPS26,产生,EPS,的能力。同时，我们再次观察到了菌体生长和,EPS,的生产之间并不偶联，因为,pH 5.0,时菌体数量达最大而,pH6.0,时,EPS,的产量达到最大。,6.,通过连续培养得到的结果表明,EPS A,和,EPS B,有着不同的生产动力学。,EPS A,主要在一个非常低的稀释率（,0.02h,-1,），有较大产率。而,EPS B,的生产并不受生长速率的影响。,分析讨论,7.,在一个低的,D(0.02,0.04h,-1,),下，相似的糖消耗与乳酸盐生产被也观察到。这个发现表明糖类作为一种重要的碳源组成部分被吸收后代谢成为与,EPS,合成有关的核糖核苷酸前体物质。,8.,结果显示，,EPS B,是牛奶培养基的主要聚合物，而在,SDM,培养基中,EPS A,是最丰富的,EPS,形式。这是一个培养基成分影响一种菌株生产不同比率的,EPS,的例子。,9.,关于两种,EPS,的结构更深入的研究正在进行中，我们希望更深入的理解它们的结构功能之间的关系。,分析讨论,谢谢大家！,加油，好好做！,