蔬菜质量安全快速检测技术与应用_48页.ppt

,*,蔬菜质量安全快速检测技术与应用,无公害蔬菜基地的认证过程,蔬菜质量安全快速检测技术的检测指标,农药残留量,(,有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药,),硝酸盐,亚硝酸盐,吊白块：目前主要在我国北方已经发现有一些不法商贩使用漂白粉漂白一些蔬菜，但情况尚不严重，其主要污染物为甲醛。,我国现行的主流检测技术体系,检测技术体系的要求：,满足有关标准对检测方法及设备的要求；,操作简便，稳定度高；,检测结果能够与其它分析机构比对。,目前全国最大的检测体系：,由农业部蔬菜品质监督检验测试中心（北京）和农业部药检所创建，并常年进行检测，具有技术成熟以及结果可靠等特点。,设备：,电子天平、电热恒温水浴锅、调速多用振荡器、,TU1800/1810,紫外可见分光光度计,要求：,同时对蔬菜中的硝酸盐、亚硝酸盐和农药残留量进行检测，需要时检验吊白块。,农药残留量快速检测方法,传统的农药残留量分析技术的一般过程,传统的农药残留量分析技术的优缺点,传统的农药残留量分析技术存在的问题,?,能对农产品的生产、运输、批发、零售环节农药残留量分析作出快速响应，无法满足农产品生产、流通环节的需要,?,检测费用太高，如果在农产品的生产、运输、批发、零售各个环节普遍使用，社会可能无法承担,?,检验缺乏针对性，在农产品的生产、运输、批发、零售各个环节普遍使用传统的农药残留量分析技术，可能会带来一定程度的浪费,?,检验需要专业的检测机构来完成，现有的社会检测机构及检验能力无法承担社会各个环节的所有检测任务,?,检验需要配置大量的仪器设备，造成了传统的农药残留量分析技术无法在商场、农产品生产基地等场所进行推广使用,国内外现行的农药残留量快速检测方法,生化检测法（胆碱酯酶,/,酶抑制法）,免疫分析法,是将抗体抗原反应与现代测试手段相结合的微量分析法。具有高灵敏度和高效能等优点，仅需要很少的仪器设备和专业培训，是农药残留量快速检测及测定致癌物的好方法。但该方法开发费用高，开发时间长约,1,年，而且只适用于分析一种农药或一类农药。,活体生测法,安达市植保植检站利用敏感家蝇对蔬菜低残毒生产区的蔬菜进行大面积多点次检测，查出严重超标的蔬菜比率为0.15%。该法测定时间需3小时，但必须具有专用养虫室并常年饲养昆虫。,我国现行的农药残留量分析的总体解决方案,农药残留量快速检测技术的优缺点,我国现行的农药残留量快速检测技术,（最新有关标准）,GB/T5009.199-2002，,由卫生部制订，是目前使用最广泛的标准。,农药的分类,农药残留量快速检测技术的检测对象,有机磷类农药,氨基甲酸酯类农药,以上两类农药的有毒代谢产物,蔬菜农药残留量危害程度评估及取样方法,评估原则：,危害性（,Hazard,）=,毒性接触程度（,Exposure,）,评估方法：,危害性越大，采样频次越高，样本数量越大，监管等级越高,蔬菜中农药残留量样品采集原则：,蔬菜品种数量越大，采样频次越高，样本数量越大。,蔬菜抽样数量在生产基地和流通环节（如：市场）均使用货物“货批”数来衡量。,产地检验原则：以同一品种、同一田块、同期采收的蔬菜，以,1,hm,2,为一抽样批次，不足,1,hm,2,也视为一个货批。,市场检验原则：以同一产区、同一品种、同一销售单位为一个货批。,产地蔬菜样品采集方法,原则：,对每一货批按,5,点抽样法取样，将样品缩分后抽取,2,kg,，,取,1,kg,样品作为备样，备样应低温保存。,产地蔬菜样品采集方法,原则：,从每一货批中随机抽取,2,kg,样品,，取,1,kg,样品作为备样，备样应低温保存。,注意：,随机随意,常见蔬菜农药残留量的采集对象及检测部位,采集对象：,蔬菜基地：上市前的蔬菜,市场：正在售卖的蔬菜,检测部位,蔬菜农药残留量快速检测结果判定基本原则,农药残留量按简易测定方法进行测定时，从每一货批中随机抽取3个样品进行现场测定。对于一次检验出现阳性时允许复测。若复测仍呈阳性者，应进行色谱测定，以色谱测定法测定的结果为判定依据。,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,原理,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,1,、试剂,速测卡：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片。,洗脱液（,pH7.5,缓冲溶液）：取,15.0g,磷酸氢二钠,Na,2,HPO,4,12H,2,O,与,1.59g,无水磷酸二氢钾,KH,2,PO,4,，用,500mL,蒸馏水溶解。,2,、仪器,常量天平,372,恒温装置（选配）,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,整体测定法,1,、选取有代表性的蔬菜样品，檫去表面泥土，剪成,1cm,左右见方碎片，取,5g,放入带盖瓶中，加入,10mL,缓冲溶液，振摇,50,次，静置,2min,以上。,2,、取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置,10min,以上进行预反应，有条件时在,37,恒温装置中放置,10min,。预反应后的药片表面必须保持湿润。,3,、将速测卡对折，用手捏,3min,或用恒温装置恒温,3min,，使红色药片与白色药片迭合发生反应。,4,、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,表面测定法（粗筛法）,1,、檫去蔬菜表面泥土，滴,2,3,滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。,2,、取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。,3,、放置,10min,以上进行预反应，有条件时在,37,恒温装置中放置,10min,。预反应后的药片表面必须保持湿润。,4,、将速测卡对折，用手捏,3min,或用恒温装置恒温,3min,，使红色药片与白色药片迭合发生反应。,5,、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,结果判定：,检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）、未抑制（阴性）表示，具体见下表：,速测卡法测定结果,阳性结果,阴性结果,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,部分常见农药的检出限及最大残留限量（单位,：,mg/kg,）,速测卡法,（,纸片法,，,GB/T 5009.1992002,）,速测卡法的使用注意事项,葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。,当温度条件低于,37,，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用（体温）手指捏,3min,时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加得过少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。,速测卡对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会造成对照和测定药片不变蓝。,红色药片与白色药片叠合反应时间以,3min,为准，,3min,后的蓝色会逐渐加深，,24h,后颜色会逐渐褪去。,酶抑制法,（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,原理,1,、,试剂,pH8.0,缓冲溶液：取,11.9mg,无水磷酸氢二钾与,3.2mg,磷酸二氢钾，用,1000mL,蒸馏水溶解。,显色剂：取,160mg,二硫代二硝基苯甲酸（,DTNB,）和,15.6mg,碳酸氢钠，,用,20mL,缓冲溶液溶解,，在,4,冰箱中保存。,底物：取,25.0mg,硫代乙酰胆碱加,8.0mL,蒸馏水溶解，摇匀后置于,4,冰箱中保存，保存期不超过一周。,乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，但吸光度值应控制在,0.3,以上。,2,、仪器,常量天平,372,恒温水浴或恒温箱,分光光度计或快速测定仪,酶抑制法,（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,分析步骤,样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，檫去表面泥土，剪成,1cm,左右见方碎片，取,1g,放入烧杯或提取瓶中，加入,5mL,缓冲溶液浸没菜叶，每,3min,摇动一下烧杯，于,10min,后吸取,2.5mL,提取液于试管，待测。,测定：,对照溶液测试：于试管中加入,2.5mL,缓冲溶液，再加入,0.1mL,酶液、,0.1mL,底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，,于,410nm,波长下比色，记录反应,3min,的吸光度变化值或仪器记录,值,A0,。,样品测试：于试管中加入,2.5mL,样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应,3 min,的吸光度变化值或仪器记录值,At,。,结果的表述计算：,注意,：使用速测仪可以直接读出抑制率值，而无须手工计算。,酶抑制法,（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,结果判定,酶抑制法（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,CL-1,型农药残留速测仪的操作步骤,将阻断光路黑块放入速测仪的比色池内，接通仪器电源，此时仪器自动进入预热阶段，显示屏显示数值为,1200,；,仪器显示数值由,1200,减少为,0,，并发出“嘀蜂鸣声时，表示仪器预热完成（整个过程约需,时,15min,）；,按下“,0”,按钮，进行调,“,0”,操作，此时仪器显示数值为,0,或其左右的数值；,取出阻断光路黑块，按下“,100”,按钮，进行调满度操作，此时仪器显示数值为,100,或其左右的数值；,放入对照溶液，按下“对照”按钮，仪器将自动进行对照样品的测试，,3min,后，仪器发出“嘀”蜂鸣声时，表示对照溶液测试完成；,取出对照溶液，放入待测样品，按下“样品”按钮，仪器将自动进行待测样品的测试，,3min,后，仪器发出“嘀”蜂鸣声时，表示样品溶液测试完成，此时按下再次“样品”按钮，仪器即可显示样品抑制率；,其余样品的测定重复步骤的操作即可。,酶抑制法（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,部分农药浓度与抑制率对照（实验条件：,37,，乙酰胆碱酯酶）,酶抑制法（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,酶抑制法的使用注意事项,葱、蒜、胡萝卜、生姜、韭菜等蔬菜中含有破坏酶活性或使蓝色产物褪色的物质，处理这类样品时，不要剪得太碎，浸提时间不要太长，必要时可采取整株（体）蔬菜浸提法。,如室温低于,20,，建议使用,30,水浴，即提取液要在水浴中预热，并且加入酶液后的试管也需要放置于水浴中，同时室温也应控制在,20,以上。,速测试剂对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会对检测结果带来影响。,速测仪长期处于开机等待状态时，应将阻断光路黑块放入速测仪的比色池内，避免仪器感光元件因过度疲劳而损坏。,标准,NY/T 4482001,使用的丁酰胆碱酯酶对甲基对硫磷、乐果、毒死蜱、二嗪磷等农药不太灵敏，检出浓度均在,10mg/kg,以上。,酶抑制法（,GB/T 5009.199-2002,、,NY/T 448-2001,）,方法特点,该方法是与国际接轨的一个农药残留量快速检测方法，它等同于美国公职分析化学师协会,AOAC 12th 29.049-29.055,食品中有机磷农药残留测定,胆碱酯酶抑制法,方法，在国外已得到普遍的应用，检测结果更具可比性。,方法检测对象广泛（有机磷农药和氨基甲酸酯类农药），而且适用于一些基质复杂的样品，例如：蔬菜、水果、茶叶和肉等。,具有较高的灵敏度。,适用的温度范围广，在,15,35,下可直接测定，无需其它温控设施。,比色波长为,600nm,。,样品测定时，无需设置对照。,测定结果表示简单，无需计算抑制率，由吸光度值直接作出判定。,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,GB/T 1862002,系列标准方法,与,GB/T 5009.1992002,等标准方法的比较,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,原理,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,1,、试剂,缓冲液：,pH 7.71,磷酸盐缓冲液（适用于蔬菜等的检测）：,A,液,1/15mol/L,磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠（,Na2HPO412H2O,）,2.3876g,，加水定容至,100mL,。,B,液,1/15mol/L,磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾,0.9078g,，加水定容至,100mL,。,取,A,液,90mL,、,B,液,10mL,混合，即得,pH 7.71,磷酸盐缓冲液。,pH8,的三羟甲基氨基甲烷（,Tris,）,盐酸缓冲液（适用于茶叶、肉等的检测）：,取,50mL0.1mol/LTris,、,29.2mL0.1mol/L,盐酸加水定容至,100mL,即可。,底物溶液,（,2%,碘化硫代乙酰胆碱水溶液）：,1g,碘化硫代乙酰胆碱，加缓冲液溶解并定容,至,50mL,即可。,显色剂：,0.04%2,6-,二氯靛酚水溶液。,氧化剂,：,0.5%,次氯酸钙水溶液。,还原剂：,10%,亚硝酸钠水溶液。,胆碱酯酶液：,0.2g,胆碱酯酶酶粉溶于,10mL,缓冲液中。,脱色剂：活性炭。,丙酮：分析纯。,碳酸钙：分析纯。,2,、仪器,常量天平,分光光度计,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,几,种,代,表,性,农,产,品,的,测,定,步,骤,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,结果判定,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,注意：吸光度值与农药残留量正相关，测定值越高，说明农药残留量越高。,GB/T 1862002,系列标准方法,对部分农药的最低检出浓度（单位,：,mg/kg,）,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,GB/T 1862002,系列标准方法的使用注意事项,如室温低于,15,，建议使用,30,水浴，即提取液要在水浴中预热，并且加入酶液后的试管也需要放置于水浴中，同时室温也应控制在,20,以上。,速测试剂对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会对检测结果带来影响。,分光光度计长期处于开机等待状态时，应将比色室盖打开，避免仪器感光元件因过度疲劳而损坏。,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,农药残留量快速检测中比色皿使用的注意事项,使用的比色皿均须用待测液润洗三遍后方可装样，如外部被浸湿可用擦镜纸擦干。,比色皿的清洗，可将比色皿浸泡在阴离子表面活性剂的碳酸钠溶液,中（,2%,W/V),，必要时应在,40-50,加热约,10min,取出然后在,1+5,过氧化氢的硝酸溶液中浸泡,30min,，用水冲洗后用蒸馏水洗净，倒立在清洁的纱布上控干。放入干燥器保存。若急用时可在水洗后用乙醇、乙醚洗涤吹干。经常使用时，洗后将比色皿浸泡在蒸馏水中保存。,GB/T 1862002,系列标准方法的应用,酶抑制法试剂质量的鉴别方法,乙酰胆碱系统,：,2002,年卫生部批准了国家标准,GB/T 5009.199-2002,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测方法,。标准规定蔬菜农残检测用乙酰胆碱系统而非丁酰胆碱（,NY/T 4482001,）。对于原来使用丁酰胆碱系统的仪器是同样可以使用乙酰胆碱的，因为这个试验的基本原理是：酶把乙酰胆碱或丁酰胆碱切成乙酰和胆碱或丁酰和胆碱，切下的丁酰和乙酰不起作用，而发生显色作用的是胆碱与显色剂产生的黄色物质，都在,410,波长处检测，并且抑制率的计算公式也是相同的。,试剂敏感度高,：,严格的方法是在控制的温度条件下参照国家标准,GB/T 5009.199-2002,中农药与抑制率对照表进行检测。比较简单的方法是，以同样的农药和方法测试不同的抑制率，记录其吸光度值与抑制率，吸光度值与抑制率都比较高的试剂是敏感度高的试剂。,酶稳定性好,：,抑制率是样品值与对照值的比较而得到的，因此酶液在检测中应始终保持同样的质量，低质量的酶液在稍高的温度下会随时间活性明显下降，因此在检测中，后检测的蔬菜会由于酶液活性的下降引起抑制率偏高，导致错误判断。判断酶液稳定性的方法是将酶液分成两部分，其一放置于,0,以下，另一放置于,30,以上，,4,小时以后按照检测对照的方法测定两个酶液的吸光度值，吸光度值差别小的酶液为稳定性好的酶液。,底物新鲜度好,：,底物具有自动水解的倾向，过度水解的底物会影响检测的正确性，并且保存时间也短，是质量差的试剂。判断底物新鲜度的方法是，在,2.5mL,提取液内加入,0.1mL,底物和,0.1mL,显色剂，然后放入仪器中看透过率，透过率大的为新鲜度好的试剂。,各种农药残留量快速检测技术在实践中的应用策略,参考网站,WWW.AOAC.COM,紫外,-,可见分光光度计的基本结构,光源,单色器,吸收池,检测器,氘灯、钨灯,石英棱镜、光栅,石英池,光电倍增管,谢谢！,