如何提高种猪效率-论冻精技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,猪精液冷冻保存技术,内 容,猪精液冷冻保存的意义,猪精液冷冻技术研究概况,猪精液冷冻技术操作流程,影响猪精液冷冻效果的因素,如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力,1,、延长公猪使用年限；,2,、获得更大的遗传进展；,2,、取代活体公猪的引进；,3,、生物安全的保证。,猪精液冷冻保存的意义,从意大利人,Spallanzani,最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有,200,多年的历史。,猪的精液冷冻研究是从,1949,年英国人,Polge,等发现甘油,(,丙三醇,),对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。,1956年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。,1957,年,Hess,等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。,1975,年，,Pursel,等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。,（用颗粒状冷冻精液给,23,头青年母猪输精,48h,后剖检,11,头,有,5,头受孕,;25-30d,后剖检另外,12,头,有,10,头怀孕）,猪精液冷冻技术研究概况,猪精液冷冻技术研究概况,我国从,70,年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。,1975,年西安市草滩农场试配了,8,头母猪。,1977,年成立了全国猪冻精协作组。,1986,年冷冻精液累计配种母猪,6,万余头，,近几年：,甘肃农业大学 张兆旺教授,南京农业大学 芮荣教授,西北农林科技大学 李青旺教授,四川农业大学 马恒东教授,东北农业大学 刘娣教授,上海农科院 张德福研究员,猪精液冷冻技术操作流程,精液采集,质量检测,第一次稀释,降温、平衡,（,15,，,5,）,第二次稀释,平衡,冷冻,保存,猪精液冷冻技术操作流程,颗粒法冻精的冷冻程序,1),新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的,I,液稀释，然后平衡,0.5,2h;,2),缓慢降温至,15,维持,4h,，再从,15,经,1h,降至,5;,3),用等温的含甘油的,II,液进行稀释。,4),稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。,利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为,1,2cm,，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为,-110,-125,，滴冻时间控制在,60s,内完成，加盖熏蒸平衡,3,4,分钟后，浸入液氮中保存。,细管法和塑料袋法的冷冻程序,1),新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡,0.5,2h,。,2),将精液移入,15,条件下降温平衡,3h,。,3),在,15,条件下离心,(800g,，,10min),加入无甘油的,I,液，缓慢降到,5,，平衡,2h,，加入含甘油的,II,液，然后分装。,4),程序冷冻仪冷冻：,初始温度为,5,，以,3,min,从5,降到,-5,，再于,-5,条件下保持,1min,结晶，然后以,50,min,从,-5,降到,-140,，然后投入液氮保存。,5),液氮熏蒸冷冻：,在广口液氮罐内，与液氮面距离,5cm,处，熏蒸,20,分钟，然后投入液氮保存。,影响猪精液冷冻效果的因素,个体的影响,个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态,(AFLP),分析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究,冻前处理的影响,冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。,猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高,胆固醇,/,磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜,离心：,800g,，,10min,影响猪精液冷冻效果的因素,冷冻保存承载工具的影响,承载工具：颗粒、,0.25mL,、,0.5mL,小型细管和扁平细管；,5mL,的大型细管,5mL,塑料袋。,如,FP(Flat-Pack,，,300mm,22mm,0.2mm),和,MFP(a multiple Flat-Pack),。,冷冻解冻程序的影响,冷冻速率：,30,50/min,。解冻速率：,1200,1800/min,冷冻,0.25mL,微型细管：,50/min,、,1.5,甘油浓度；,0.5mL,小型细管：,30/min,、,3,甘油浓度；,5mL,大型细管：,16/min,、,3.3,甘油浓度。解冻,0.25mL,、,0.5mL,细管：,50,，,12s,或,37,，,20s,；,5mL,细管：,50,，,40s,5mL,塑料袋：,50,，,13s,影响猪精液冷冻效果的因素,稀释液的组成,大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。,渗透压的影响,最佳渗透压：,420,580mOsm/Kg,为最佳渗透压,糖的影响,双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等）顶体完整率；,单糖（尤其是果糖和木糖）精子冻后活率。,配合使用效果比单一使用好,影响猪精液冷冻效果的因素,冷冻保护剂的影响,常用：甘油、二甲基亚砜,(DMSO),、丙二醇,(PROH),、乙二醇,(EG),、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。,作用过程：,（,1,）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替；,（,2,）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度；,（,3,）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。,效果：甘油保护效果最好，但有毒。,方向：联合使用，最终除去甘油,影响猪精液冷冻效果的因素,添加物的影响,缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、,Tris,等；,抗菌：青霉素、链霉素等；,洗涤剂：,OEP,（氨基,-,钠十二烷基硫酸酯）、,SDS,（十二烷基硫酸钠）等；,抗氧化：维生素,E,、,GSH,（谷胱甘肽）等,激素类：,PGF2a,其他：透明质酸、,N-,乙酰基,-D-,氨基葡糖等,影响猪精液冷冻效果的因素,抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究,抗氧剂种类,效果,维生素,E,200mol,水溶性,VE,提高解冻后精子的活力和线粒体的活性；,200-1000mol-VE,能提高解冻后精子的活力，,200mol,能保护精子脂质的氧化,谷胱甘肽（,GSH,）,获能状精子减少，体外受精率提高,二丁基羟基甲苯（,BHT,）,添加,0.2,、,0.4,、,0.8mmolBHT,，解冻后精子存活率提高，脂质氧化降低，体外受精的胚胎发育率得到提高（,16,：,29,，囊胚发育率）,过氧化氢酶（,Catalase,）,单独或与,SOD,联合使用能提高解冻后精子存活率。与丙酮酸，巯基乙醇一起添加，显著提高解冻后精子的活力，但是对精子的形态和存活时间无影响。,超氧化物歧化酶（,SOD,）,单独或与过氧化氢酶联合使用，提高解冻后精子存活率。,如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力,选择优良的个体,稀释液中要添加抗氧化的物质,BHT,GSH,SOD,过氧化氢酶，,VE,等。,输精时间要尽可能和排卵时间吻合,提高输精精子剂量,谢谢大家,