液相色谱2-分配、离子交换、凝胶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节 分配色谱,一、基本原理,1、吸附色谱的局限性,（1）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物质（成分）；,（2）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响较大，常使结果重现性较差；,（3）易出现拖尾峰。,2、分配色谱原理,（1）固定相为液体,将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为,固定相,。,吸附剂颗粒表面或纸纤维叫,载体或担体,。,根据组分在两相中的,溶解度不同,而分离。,（2）,“相似相溶”,原则,极性物质在极性溶剂中溶解度大，K大；,非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，K大。,（3）分配定律与分配等温线,（4）分配色谱的特点：,a、重现性,b、峰对称,c、无强烈滞留现象.,几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。,二、载体,只起负载固定相的作用。,要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒均匀。,种类,1）硅胶：重现性差,2）硅藻土：应用最多,3）纤维素：纸色谱,三、固定相和流动相的选择,正相分配色谱：,固定相的极性,大于,流动相的极性；,固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。,流动相：石油醚等,洗脱顺序:,极性大,的组分,保留作用强,；极性小的组分保留作用弱,反相分配色谱,：固定相的极性,小于,流动相的极性。,固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂。,流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲液）、与水混合的有机溶剂。,洗脱顺序:,极性小,的组分,保留作用强,；极性大的组分保留作用弱,四、分配色谱操作注意事项,1、两相溶剂的处理,2、上样量与样品前处理。,3、柱色谱,4、纸色谱,第三节 离子交换色谱法,(ion exchange chromatography),一、基本原理,1、离子交换剂与离子交换过程,（1）离子交换剂,为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能自由移动。,可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离子交换。,（2）离子交换过程,水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离子被置换，进入流动相而发生置换。,带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：用于阳离子分离；,带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子分离。,2、分离机理,（1）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。,（2）离子交换平衡：,K 大，Na+易与固定相结合，移动慢；,反之，移动快。,t,R,=t,m,(1+K),V,R,=V,m,(1+K)=V,m,KV,S,K为分配系数,平衡时,K,为选择性系数,（交换平衡常数）,二、离子交换树脂,1、离子交换树脂的构成,由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机溶剂，性质稳定。,苯乙烯组成长链；,二乙烯基苯为交联剂,2、离子交换树脂的类型,（1）阳离子交换树脂 可交换的离子为阳离子。,氢型、钠型,强酸型、弱酸型、中强酸型（COOH、PO,3,H、SH）,例如：磺酸型 R-SO,3,H,+,(pH范围宽),*应注意pH范围，否则交换容量急剧下降。,（2）阴离子交换树脂 可交换的离子为阴离子。,按不同碱性分：,强碱型（季胺基团）NR,3,+,(pH11),NH,2,NHR,NR,2,等(pH B,3+,C,2+,D,+,大分子量的有机离子,有较高的亲和力,四、流动相,1、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的pH值）。,2、对分离的影响,2、对分离的影响,流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对的过程,pH对弱酸、弱碱的影响,影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：,离子,组分,，则K,；离子,组分,，则K,不同离子交换剂的pH适用范围：,强酸型：较宽;强碱型：,pH,6;弱碱型：,pH,2000）,一、基本原理,1、分离机理,（1）前三种是亲和力不同而分离；,（2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离；,（3）凝胶 有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。,小分子:将全部渗入细孔中,在流经柱时,经历的路程最长.,中等大小分子:渗入部分较大的孔隙,而被较小的孔隙排斥,经历的路程居中.,大分子:完全被排斥在空隙外,经历的路程最短.,所以洗脱次序仅是分子大小(分子量)的函数。,分子大小受分子量,分子几何形状（环球形、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关,。,Size Exclusion Chromatography,2、分配系数和保留值,(1)分配系数K,组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时,a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外。,C,S,=C,m,K=1,b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固定相孔隙之外,C,S,=0 K=0,c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，,0K1,所以在凝胶色谱中 0K1,（2）保留值,保留方程 V,R,=V,m,+KV,S,在凝胶色谱中 V,m,：外水体积（V,0,）,V,S,：内水体积（V,i,）,当 K=1 时，V,R,V,m,V,S,V,0,V,i,K=0 时，V,R,V,m,V,0,所以，所有组分均在（V,i,+V,0,）,体积内流出,。,二、凝胶类型 （自学）,1、葡聚糖凝胶,2、聚丙烯酰胺凝胶,3、琼脂糖凝胶,4、多孔玻璃凝胶,14 用于亲水性样品的分离,5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品亲脂性）,三、实验条件的选择,分子量较正曲线,将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。,图中，A、B两点反映了该固定相能够分离的组分分子量的上限(排斥极限)、下限(全渗透极限)，只有分子量在A、B对应量之间的组分才能被分离。,1、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）,2、凝胶的溶胀,干凝胶+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；,注意：时间足够长，不易过稀。,3、装柱：不应有气泡。,柱长100cm,4、样品的制备,组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的2530%。,K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的25。,5、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。,洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pH的缓冲液、水,有机溶剂混合液。,6、应用：测定大分子物质的分子量（如Pr）,