第六章好氧发酵机制1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第六章 有机酸发酵机制,一,.,概述,有机酸,：给出氢离子的有机物。,泛指,:,羧酸（,R-COOH,）、磺酸（,R-SO,2,OH,）、,亚磺酸（,R-SOOH,）、硫代羧酸（,R-COSH,）,种类多：一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸,多元羧酸,不饱和羧酸，,广泛存在于植物果实中。,糖、淀粉、酒精、石油等均可经微生物转化生成各种有机酸,最早,:,醋酸和乳酸,贾思勰,齐民要术,记载了,23,种酿醋方法,我国已经投产：柠檬酸、葡萄糖酸、长链二羧酸、曲酸等,二,.,有机酸应用,1.,在食品和饮料中的应用,酸味剂,:,汽水、硬糖、冰淇淋,水果罐头、果冻、果酱,保色作用,抑制腐败微生物生长,2.,在医药工业中的应用,柠檬酸及钠盐是很好的抗凝血剂,葡萄糖酸钙补钙,3.,在化学工业中的应用,洗涤剂（脱锈）,:,无毒、无污染,无毒电镀,:,柠檬酸盐镀锌溶液代替氰化物,化妆品、香皂沐浴液,:,防止氧化和除臭,4.,其它工业,卷烟,(,乳酸或乳酸钠,):,防干燥、防霉变、增香,处理纤维,(,乳酸,):,柔软、光泽,显影剂,(,酒石酸,),乳酸钙是重要的医药和饲料添加剂,第一节,柠檬酸发酵机制,柠檬酸（,citric acid,）,枸橼酸。学名：,2-,羟基,-,丙烷三羧酸或,-,羟基丙三酸,分子式,C,6,H,8,O,7,，分子量,192.13,无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体,柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛的用途,柠檬酸的生产：,1874,年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；,1913,年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。,1893,年前，主要从柑橘、菠萝和柠檬等提取,1893,年后发现微生物（青霉）可产生柠檬酸,1951,年美国,Miles,公司首先深层发酵法生产柠檬酸（,Aspergillus niger,）,我国,20,世纪,40,年代初开始浅盘发酵生产柠檬酸,60,年代深层发酵,柠檬酸生产菌,青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉等利用淀粉质原料大量积累柠檬酸,国内利用,黑曲酶（,Aspergillus niger,）,工艺,:,固体或液体深层发酵,原料,:,甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、玉米等,柠檬酸发酵的原理,己糖、淀粉等原料,柠檬酸,生化过程复杂,EMP,糖酵解途径,丙酮酸羧化,通过三羧酸循环形成柠檬酸,一、三羧酸循环,三羧酸循环,TCA,环的总反应式为：,CH3COSCoA+2O2+12(ADP+Pi)2CO2+H2O+12ATP+CoA,TCA,环产生能量的水平是很高的，每氧化一分子乙酰,CoA,，可产生,12,分子,ATP,。,TCA,循环的意义：,（,1,）生理意义：在一切分解代谢和合成代谢中占有枢纽地位，在动植物和微生物细胞中普遍存在，不仅是糖分解代谢的主要途径，也是脂肪、蛋白质分解代谢的最终途径，具有重要生理意义,（,2,）实践意义：与微生物大量发酵产物如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和谷氨酸等的生产密切相关。,柠檬酸是葡萄糖经,TCA,循环形成的最有代表性的发酵产物。,二、柠檬酸生物合成途径,主要生产菌：,黑曲霉,TCA,循环与柠檬酸的形成,柠檬酸合成中,CO,2,固定系统,存在两个,CO,2,固定系统（需,Mg,2,、,K,）：,1,）丙酮酸（,PYR,）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）,2,）磷酸烯醇丙酮酸（,PEP,）在,PEP,激酶的作用下，生成草酰乙酸,三、柠檬酸生物合成的代谢调节,（,一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节,1正常情况下，柠檬酸、,ATP,对磷酸果糖激酶有抑制作用，而,AMP,、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、,ATP,对磷酸果糖激酶的抑制作用。,铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,2.,比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。,锰缺乏时，细胞内,NH,4,浓度高，,Aa,浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过,NH,4,升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的,。,3.,丙酮酸激酶是,EMP,途径的第,2,个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。,（二）、,TCA,循环的调节,1,、,TCA,环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。,但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉,TCA,环的第一个特点。,顺乌头酸酶失活，阻断,TCA,环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要,Fe,2,。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在,pH2.0,时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使,pH,值降低。,2.,第二个特点：黑曲霉菌体内,-,酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（,TCA,环被阻断），它被葡萄糖和,NH,4,抑止,。（,是,TCA,循环中唯一不可逆的反应步骤）,3.,氧和,pH,值对柠檬酸发酵的影响很大。,氧是发酵过程（,EMP,途径和丙酮酸脱氢）生成的,NADH,2,重新氧化时所需,标准呼吸链产生,ATP,积累，侧呼吸链不产生,ATP,，缺氧导致侧呼吸链失活，使,ATP,积累，柠檬酸积累减少。,TCA,循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：,（,1,）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键,（,2,）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力,（,3,）,TCA,循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。,柠檬酸的积累机制,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰,CoA,和,CO2,固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,同时控制,Fe,2+,含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。,随着柠檬酸积累，,pH,降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。,三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸,丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成,存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的,C4,二羧酸只能由乙醛酸提供。,乙醛酸循环,第二节、氨基酸发酵机制,一、氨基酸发酵的代谢控制,二、谷氨酸的发酵,二、谷氨酸的发酵,1.,谷氨酸生产菌中存在,2,个糖酵解途径,EMP/HMP,生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度,而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变,丙酮酸积累,乳酸积累,2.,-,酮戊二酸脱氢酶缺失,TCA,环阻断，,-,酮戊二酸积累,3.,四碳二羧酸的来源,在生产菌中检出,CO,2,固定反应酶活,性,磷酸烯醇丙酮酸,(PEF),羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到,81.7%,DCA,循环,标志酶：异柠檬酸裂解酶,在谷氨酸发酵中，DCA,环一方面可以作为,TCA,循环有缺陷时,C4,二羧酸的补充,在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量,作用,谷氨酸生成期中要封闭,DCA,环,？,通过,DCA,环提供,C4,二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为,54.4%,4.,异柠檬酸脱氢酶活力强,提供,NADPH,用于还原,-,酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系,5.,氨的导入,合成谷氨酸的反应有,3,种：,-,酮戊二酸,+,NH,4,+,NADPH,+,谷氨酸,H,2,O,NADP,+,+,谷氨酸脱氢酶,-,酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,谷氨酸,-,酮戊二酸,+,-,酮戊二酸,+,谷氨酰胺,NADPH,+,2,谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,生产菌中,谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑,谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视,谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶,氨的导入时,生物素缺乏，,NH,4,+,影响糖代谢速度：提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时，,NH,4,+,不影响糖代谢速度,6.,谷氨酸合成的调节机制,谷,aa,比天冬,aa,优先合成,谷,aa,脱氢酶,谷,aa,对其反馈抑制和反馈阻遏,柠檬酸合成酶,TCA,的关键酶，受能荷调节，谷,aa,反馈阻遏，乌头酸反馈抑制,异柠檬酸脱氢酶,-,酮戊二酸反馈抑制,-,酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱,PEP,受天冬,aa,反馈抑制，受谷,aa,和天冬,aa,反馈阻遏,7.,细胞膜通透性控制,