细胞培养中的细节问题.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基础篇,-,实验用品,细胞培养中的细节问题,1.,清洗,1.1.,新购玻璃血清瓶先以,0.10.05 N,HCl,浸泡数小时，洗净后才开始使用。,1.2.,用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。,2.,灭菌,2.1.,实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌,121,20,分钟，置于,oven,中烘干。,2.2.,实验用玻璃,pasteur,pipet,以干热灭菌,170,4,小时。,2.3.,液体或是固体废弃物可用,10%,hypochloride,溶液,(,次氯酸，即漂白水,),或是蒸汽高压灭菌,121,20,分钟处理。,基础篇,-,抗生素,1.,细胞库之细胞培养基不加抗生素,1.1.,培养自,ATCC,引进之细胞株，培养基中不加抗生素。,1.2.,培养自其它实验室引进之细胞株，制作,token freeze,前培养基须添加抗生素，待,token freeze,通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。,2.,寄送活细胞时，须将培养液充满整个,flask,时，则须添加抗生素,(penicillin 100 units/ml+streptomycin 100,ug,/ml),。,3.,若要检测,mycoplasma,，则培养基内不可添加,gentamicin,，因,gentamicin,会抑制,mycoplasma,生长。,4.,去除细菌污染之抗生素混合配方,:penicillin 250 units/ml,streptomycin 250,ug,/ml,neomycin 250,ug,/ml,bacitracin,2.5 units/ml,，注意混合使用后药物毒性会增强。,5.,抗生素使用种类与浓度：工作浓度,.,储存温度,杀灭细菌,penicillin 100 units/ml -20 G(+)bacteria streptomycin 100,ug,/ml -20 G(+)and G(-)bacteria,chlotetracycline,50,ug,/ml -20 G(+)and G(-)bacteria,gentamicin,50,ug,/ml -20 G(+)and G(-)bacteria,mycoplasma,amphotericin,B 2.5,ug,/ml -20 yeast and molds,nystatin,50,ug,/ml -20 yeast and molds,fungizone,2.5ug/ml -20 yeast and molds,基础篇,-,血清,1.,血清必须贮存于,20,-70,，若存放于,4,，勿超过一个月。,2.,血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。,3.,瓶装,(500ml),血清解冻步骤,(,逐步解冻法,):-20,或,70,至,4,冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以,50 ml,无菌离心管可分装,40,45 ml,。在溶解过程中须规则摇晃均匀,(,小心勿造成气泡,),，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由,20,直接至,37,解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。,4.heat-inactivation,是指,56,30,分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。,5.,勿将血清置于,37,太久，若在,37,放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。,6.,血清之沉淀物,6.1.,凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白,(lipoprotein),变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白,(fibrin),造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。,6.2.,显微镜下观察之,“,小黑点,”,：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是,“,小黑点,”,，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在,37,中欲培养此,“,微生物,“,，但在,37,环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。,基础篇,-,细胞传代培养,1.,细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为,1:3,至,1:6,，依细胞种类而异。,2.,附着型胞,(adherent cell),2.1.,吸掉旧培养液。,2.2.,加入,trypsin,-EDTA,溶液，,37,作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉,trypsin,-EDTA,溶液，加入适量含血清之新鲜培养基终止,trypsin,作用，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。,2.2.,悬浮型细胞,(suspension cell),2.2.1.,吸出细胞培养液，放入离心管中，离心,1000 rpm 5,分钟。,2.2.2.,吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。,2.3.,融合瘤,(,hybridoma,),2.3.1.,有些,hybridoma,cell,需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。,基础篇,-,细胞冷冻保存（一）,1.,注意事项：,1.1.,欲冷冻保存之细胞应在生长良好,(log phase),且存活率高之状态，约为,80,90,致密度。,1.2.,冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如,hybridoma,应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。,1.3.,注意冷冻保护剂之品质。,DMSO,应为试剂级等级，无菌且无色,(,以,0.22,micronFGLP,Telflon,过滤或是直接购买无菌产品，如,Sigma D-2650),，以,510 ml,小体积分装，,4,避光保存，勿作多次解冻。,Glycerol,亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。,1.4.,冷冻保存之细胞浓度：,1.4.1.normal human fibroblast:13 x 10,6,cells/ml,1.4.2.,hybridoma,:13 x 10,6,cells/ml,，细胞浓度不要太高，某些,hybridoma,会因冷冻浓度太高而在解冻,24,小时后死去。,1.4.3.adherent tumor lines:57 x 10,6,，依细胞种类而异。,Adenocarcinoma,解冻后须较高之浓度，而,HeLa,只需,13 x 10,6,cells/ml,。,1.4.4.other suspensions:510 x 10,6,cells/ml,human lymphocyte,须至少,5 x 10,6,cells/ml,。,1.5.,冷冻保护剂浓度为,5,或,10,DMSO,，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个,backup culture,，以防止冷冻失败。,1.6.,冷冻方法：,1.6.1.,传统方法,:4 10,分钟,-20 30,分钟,-80 16-18,小时,(,或隔夜,)-,液氮槽,vapor phase,长期储存。,1.6.2.,程序降温：利用等速降温机以,1,-3/,分钟之速度由室温降至,120,，放在液氮槽,vapor phase,长期储存。适用于悬浮型细胞与,hybridoma,之保存。,2.,步骤：,2.1.,冷冻前一日更换半量,/,全量培养基，观察细胞生长情形。,2.2.,配制冷冻保存溶液,(,使用前配制,),：将,DMSO,加入新鲜培养基中，最后浓度为,5-10,，混合均匀，置于,4,待用。,2.3.,依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液,(,约,0.1 ml),计数细胞浓度及冻前存活率。,2.4.,离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，调整细胞浓度，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，,1 ml/vial,，并取少量细胞悬浮液作污染检测。,基础篇,-,细胞冷冻保存（二）,基础篇,-,冷冻细胞活化,1.,冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。,2.,细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常,(,例如产生单株抗体或是其它蛋白质,),。,基础篇,-,收到细胞的处理方式,(,一,),1.,收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存,(,置于,70,，隔夜后，移到液氮,),。,2.,冷冻细胞解冻程序,:,2.1.,依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。,2.2.FBS,、,CS,和,HS,对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。,基础篇,-,收到细胞的处理方式,(,二,),收到,T25 flask,细胞时，处理方式为,1.,于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，,T25 flask,均加满培养基。请检查,flask,外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。,2.,将原封之,T25 flask,静置于,37,，,5%CO,2,培养箱中，使细胞回温至,37,，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出,flask,内之培养基，仅留约,5-10ml,培养基于,flask,内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。,升级篇,-,细胞培养,1,1.,冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入,37,水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在,1,分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。,2.,细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除,DMSO,？除少数特别注明对,DMSO,敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有,10-15ml,新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除,DMSO,即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。,3.,可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。,4.,可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。,5何谓,FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetal bovine serum),和,FCS(fetal calf serum),是相同的意思，两者都是指胎牛血清。,CS(calf serum),则是指小牛血清。,HS(,horseserum,),则是指马血清。,升级篇,-,细胞培养,2,1.,欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为,300 xg(,约,1,000rpm),，,5-10,分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。,2.,细胞之接种密度为何？,依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。,3.DMSO,之等级和无菌过滤之方式为何？,冷冻保存使用之,DMSO,等级，必须为,Tissue culture grade,之,DMSO(,如,Sigma D2650),，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于,4,，避免反复冷冻解冻造成,DMSO,之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤,DMSO,，则须使用耐,DMSO,之,Nylon,材质滤膜。,升级篇,-,细胞培养,3,1.,如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？直接灭菌后丢弃之。,2.,支原体,(,mycoplasma,),污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？,不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。,3.,支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为,mycoplasma,-free,，实验结果之数据方有意义。,4.,侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,升级篇,-,细胞培养,4,1.,为何培养基保存于,4,冰箱中，颜色会偏暗红色，且,pH,值会越来越偏碱性？培养基保存于,4,冰箱中，培养基内之,CO,2,会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂,(,通常为,phenol red),的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之,CO,2,，以调整,pH,值。,2.,各种细胞培养用的,dish,，,flask,是否均相同？不同厂牌的,dish,或,flask,，其所,coating,的,polymer,不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之,dish,或,flask,而有显著之生长差异。,3.,购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。,4.,购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于,80,太久。,5.,收到之冷冻管瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧,升级篇,-,细胞培养,5,1.,如何选用特殊细胞系培养基？首选,MEM,做粘附细胞培养、,RPMI-1640,做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选,AIM V,（,12005,）培养基（,SFM,）。,2.,什么培养基中可以省去加酚红？,研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。,升级篇,-,细胞培养,6,1.,培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。,2.,二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入,EDTA,的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。,EDTA,用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用,EDTA,清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。,升级篇,-,细胞培养,7,1.,当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的,50%,。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。,2.,一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。,3.,大部分添加物和试剂最多可以冻融,3,次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。,细胞分离试剂（,1,大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞,HBSS,或无钙镁,PBS,0.25,胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中,细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系,HBSS,或无钙镁,PBS,0.05,胰蛋白酶溶解在,0.53mM EDTA,弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞,HBSS,或无钙镁,PBS,EDTA,甘油 溶解在柠檬酸钠中,细胞分离试剂（,2,）,强贴壁早代细胞系,HBSS,或无钙镁,PBS,0.25,胰蛋白酶溶解在,1mM EDTA,，,Dispase,0.6-2.4,单位,/ml,溶解在,PBS,上皮细胞,0.5mM-1mM EDTA,0.5mM-1mM EDTA,，,Dispase,0.6-2.4,单位,/ml,溶解在,PBS,强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞,0.5mM-1mM EDTA,0.25,胰蛋白酶,1mM EDTA,，,Dispase,0.6-2.4,单位,/ml,溶解在无钙镁,PBS,厚培养物，多层富含胶原的密集培养,1mM EDTA,0.25,胰蛋白酶，,200,单位,/ml,胶原酶，,1mM EDTA,溶解在无钙镁平衡盐溶液中,培养液,pH,值变化太快,CO,2,张力不对。培养瓶盖拧得太紧。,NaHCO,3,缓冲系统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污染。,（,1,）按培养液中,NaHCO,3,浓度增加或减少培养箱内,CO,2,浓度，,2.0g/L,到,3.7g/L,浓度,NaHCO,3,对应,CO,2,浓度为,5,到,10,。（,2,）改用不依赖,CO,2,培养液。,松开瓶盖,1/4,圈。,加,HEPES,缓冲液至,10,到,25mM,终浓度。,在,CO,2,培养环境中改用基于,Earle,s,盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用,Hanks,盐配制的培养液。,培养液出现沉淀，但,pH,值不变,用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻保存培养液。,用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。,将培养液加热到,37,，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。,培养液出现沉淀，同时,pH,发生变化,细菌或真菌污染,丢弃培养物。,或用抗生素除菌。,培养细胞不贴壁,胰蛋白酶消化过度,、,支原体污染、培养液中无贴壁因子。,缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。,分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。,悬浮细胞成簇,培养液中含钙、镁离子；支原体污染；蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放,DNA,。,用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获单细胞悬液。,分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。,用,DNase,I,处理细胞。,原代细胞培养物污染,原代培养组织在进入培养前已污染,培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。,培养细胞死亡,培养箱内无,CO,2,；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液种有毒代谢产物堆积。,检测培养箱内,CO,2,检查培养箱内温度,取新的保存细胞种,检测培养液渗透压。加入额外试剂如,HEPES,或药物都有可能影响培养液渗透压。,换入新鲜培养液,培养细胞生长减慢,由于接种细胞起始浓度太低；细胞已老化；支原体污染；更换不同培养液或血清；培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；培养物中有少量细菌或真菌污染；试剂保存不当。,比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。,增加起始培养细胞浓度。,让细胞逐渐适应新培养液。,换入新鲜配制培养液。,补加谷氨酰胺或生长因子。,用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。,血清需保存在,-5,到,-20,。培养液需在,2,8,避光保存。含血清完全培养液在,2-8,保存，并在,2,周内用完。,换用新的保种细胞。,