细胞总RNA提取及逆转录.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学实验,1,、每组同学做一份实验；,2,、遵守实验室规则，穿白衣；,3,、同学们在听课时要作好记录,;,4,、上课时间。,欢迎大家参加分生实验课的学习！,1.,实验成绩考核占总成绩,15%,。,2.,每次实验报告,5,分含随堂测试，共三次，合,15,分。,3.,缺实验,课,成绩者，本课程不予通过。,【,每名同学的,3,个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。,】,2013,年 五年制 实验课考试形式,1.,加样器,2.,离心机,先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法,3根据取样量，,选择合适量程的加样器,。,顶部标记加样器的,最大量程,，分别为：,20,l:0.5 20,l,100,l:20 100,l,1000,l:,200,1000,l,一、加样器的使用及注意事项,1,、用途,微量吸取液体,2,、每组,3,支加样器,Q,：,如果要吸取,5l,、,50l,、,150l,、,500l,的液体，应选择哪个加样器,?,练习：加样器读数为,100,，实际体积各为多少,?,4,、如何调节？,(1),首先观察目前的读数,假设为,050:,最大量程为,20,l,的加样器,5,l,最大量程为,100,l,的加样器,50,l,最大量程为,1000,l,的加样器,500,l,(2),顺时针调节,-,读数变小,逆时针调节,-,读数变大,(3),注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,5,、加样器使用步骤：,1,）选择加样器,观察读数,调节读数。,安装吸头要,紧密,(,不要用手直接拿吸头,),，安装后旋转固定一下。,2,）在,液面外,，先按到,第一,挡,。,3,）将吸头插入液面下的,适当深度,:,过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。,4,）,缓慢,松开拇指,吸取液体。,完全放开拇指后，,停留,半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。,5,）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去,6,）贴容器内壁，加样器推到,第二挡,将液体,匀速,打出。,(,吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！,),7),观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。,第一挡为实际读数体积，,第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。,1,、打开电源,2,、离心管中的液体为,2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,1,代表转速盘上方的数据，,2,代表下方的数据。,3,、将样品,标记,好并配平,对称,放入离心机（管的连接处朝外）。,4,、设定离心的转速和时间。,5,、,统一,离心。,Team Work,二、离心机的使用,及注意事项,实验一、细胞总,RNA,的提取及逆转录实验内容：,1,、小鼠肝脏组织,总,RNA,的提取,2,、,RNA,的,变性,琼脂糖凝胶,电泳,3,、以总,RNA,为模板的,逆转录,反应,一、真核细胞的总,RNA,1,、,mRNA,:1-5%,5,鸟嘌呤,7,位甲基化,CH,3,修饰。,1,）免受核酸酶破坏，,2,）起始、促进蛋白质合成。,3poly(A),尾巴结构,20-200,个,A.,翻译所必需。,起始密码：,AUG,终止密码：,UAA,UAG,UGA,。,2,、,tRNA,:10-15%,3,、,rRNA,:80-85%,大亚基,60S:,28S,=4718nt 5S=120,nt,5.8S=160,nt,小亚基,40S:,18S1874nt,第一步：提取小鼠肝脏组织的,RNA,二、,RNA,提取的注意事项,RNA,酶,：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。,生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。,1,、尽量避免,外,源性,RNase,污染,A.,操作环境空气洁净。带手套、口罩。,B.,用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）,C.,一次性塑料器材最好是新开封，,(DEPC,水处理后）高压灭菌。,D.,玻璃器材、水都应该经过去,RNase,处理。,对玻璃器材还应该进行高温烘烤。,2,、抑制,内,源性,RNase,活性：,RNase,抑制剂,。,RNA,分离的关键因素：避免,RNA,酶的污染。,1),发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。,将,1mL,Trizol,试剂移入,Eppendorf,管中。,2),实验教师操作,:,取新鲜小鼠肝脏组织,，,组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。,3),将研磨后的组织,(,小米粒大小,),转移至,1mL,的,Trizol,试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合,2min,以上。使组织细胞,充分裂解,。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。,4),室温孵育,10 min,。,三、,RNA,提取的实验操作,1,、,异硫氰酸胍法,：,GuSCN,是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性,RNase,的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总,RNA,。,特点：需低温操作，但价格经济。,2,、,Trizol,试剂,（商品化产品）,特点：在室温下可以提取细胞总,RNA,，,简单、快速、提取量大、纯度高。,3,、,mRNA,提取试剂盒,真核细胞,mRNA,的,3,末端有,ploy(A),尾，利用寡聚,dT,纤维素结合,mRNA,，,将其从细胞总,RNA,中分离出来。,课间介绍,RNA,提取的几种方法,RNase,抑制剂介绍,1,、,DEPC,(,二乙基焦炭酸盐,),最常用的,RNase,抑制剂,:,与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。,有效浓度：,0.05%-0.1%(DEPC,水,),，室温磁力搅拌,20,分钟。用于浸泡各种器材。,灭活条件：高压。,在,Tris,溶液中半衰期为,1.25min,。,试剂的配制,:,无,RNase,的溶液,(,用,DEPC,水配制,高压,),储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。,4,C,，,或液氮中。,2,、,肝素,：,使用浓度：,0.110mg/ml,效 果,:37,C,时，可抑制,95%,的,RNase,活力。,如果与,DEPC,联合应用，具有极强的抑制 效果。,5),加入,200,l,氯仿,，,震荡混匀,20-30s,，,室温放置,5min,（此期间液体开始,分层,，,此时不要轻易搅动液体,）。,)10000 rpm,，离心,5min,。,RNA,(,清澈透明,),DNA,Protein,7),将清澈透明的,上,层水相,转移至另一离心管中。,三、,RNA,提取的实验操作,8),沉淀,RNA,：,加入,0.5ml,异丙醇,，上下颠倒混匀，室温放置,10min,。,10000rpm,，离心,10min,。弃上清。,),加,1ml,75%,乙醇,洗涤管壁。,(,注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀,),10)7500rpm,离心,1min,，,弃上清。,再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。,用,TriZol,试剂提取总,RNA,时，全程均在,室温,进行。,当,RNA,沉淀用水溶解后，应该注意在,冰上,操作，操作要迅速。,12),室温干燥,3,5min,。,（干燥的时间由,RNA,沉淀大小决定）,（干燥后的沉淀应该是,无色胶样透明状,，,沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键,）,注意事项,：,RNA:,避免放在,37,C,孵箱中过度干燥以防无法溶解。,RNA,沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成,RT,的失败，但过分干燥又是造成,RNA,不溶解的主要原因。,判断,RNA,沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。,RNA pellet,：透明胶样,干燥后应该无色透明,13,）,RNA,的溶解：用加样器吸取冰冷,DEPC-H,2,O,13.5,l,，加到,RNA,上，反复吹打溶解,RNA,沉淀。,溶解的,RNA,应置冰上保存,。,14),吸出,4.5,l,溶液放到冰上备用,(,将用于,电泳,),。,15),剩余,9,l,溶液放到冰上备用（将用于,RT,PCR,）。,注意：,RNA,沉淀的溶解一定要耐心充分，,一定,要用加样器,反复,多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响,RNA,的溶解。,避免气泡的方法：,用加样器的第一挡,每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度：,吹打时液体流动不拐弯为止。,逆转录酶：,存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型,37,o,C,，禽类型,42,o,C,。,以,mRNA,为模板的,DNA,聚合酶，形成与,RNA,碱基相互补,DNA,链，后者称为互补,DNA,cDNA,。,RNAaseH,的活性：切掉,DNA,和,RNA,杂合链上的,RNA,。,第二步：逆转录反应,AAAAAA(n,),mRNA,AAAAAA(n,),3,-,TTTTTT(18)-5,68-70,o,C,annealing,AAAAAA(n,),3,-,TTTTTT(18)-5,37-42,o,C,RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,第一步：,打开,RNA,链之间的二级结构，,使,Oligo,dT,特异性地结合到,PolyA,尾。,总,RNA 9,l,Oligo,dT,(0.05,g/ml)1,l,(,终浓度：,2.5,ng,/ml),轻弹管底混合，置,65,水浴,10min,，,然后,立即冰浴,2min,（防止,RNA,形成二级结构）。,在水浴,10,分钟时，开始,RNA,电泳。,按照下列方法进行,RT,反应：,RNA,的变性,（甲醛变性法）：,打开,RNA,分子二级结构，其分子量和电泳距离相关。,5,甲醛变性缓冲液,2,l,甲酰胺,10,l,37%,甲醛,2,l,RNA,样品,4.5,l,上样缓冲液,3,l,混匀后，,21.5,l,直接电泳上样（,100,伏，,10,30,分钟）,上样前可先预电泳,5min,。,注意,:,电泳槽的清洁！,所有试剂、器材、溶液需要灭,RNA,酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制！,紫外透射仪观察电泳结果,第三步：,RNA,的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,第二步：,向上述反应溶液中依次加入下列试剂：,5,RT-buffer 4,l,RNasin,(40U/ml)1,l,dNTPs,(10mmol/L)4,l,AMV 1,l,轻弹管底混合，置,42,水浴,1h,。,将上述反应移至,68,水浴,10min,（灭活,RTase,），,并冰浴，保存备用。,混匀后，可用离心机甩一下,基本过程同,DNA,电泳一样，但：,1.,必须用对,RNA,酶有抑制作用,DEPC,水来配置所有溶液，所有与,RNA,接触的仪器和装置都要严格处理以,尽量减少,RNA,酶对样品的降解,；,2.,因为,RNA,分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以,打开其空间结构,，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。,RNA,电泳,RNA,电泳结果,rRNA,可以作为内部,Marker,分子，通过观察,rRNA,的两条带,（,28S,和,18S,）,的比例,，可以判断所提取,mRNA,是否存在降解。,RNA,电泳并不能判断,mRNA,是否提取成功，也不作为鉴定,RNA,提取质量的常规方法，因为,在电泳过程中,RNA,可能发生降解,。,分析本次实验结果：,28S,、,18S,和,5S,的比例。,RNA,电泳结果分析,RT,引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。,关键点：,RNA,是否充分溶解,根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用,1ml,Trizol,试剂提取出来的总,RNA,适合于,20,l,体积的逆转录反应体系。,引物的量是否合适,高温退火避免,Oligo,dT,锚锭点错误，同时，打开,RNA,链之间的二级结构，利于,RT,。,退火后一定迅速放在冰上,实验报告思考题：,提取细胞内,RNA,时，如何防止,RNA,酶的污染？,如何分析,RNA,变性电泳的结果，可以据此准确判断,RNA,是否降解吗？为什么？,实验结束后：,整理实验台；,交实验报告；,值日生值日。,Thanks everyone,