第五章--亲和层析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 亲和层析,第一节 亲和层析基本原理,第二节 亲和层析操作,第三节 亲和层析应用,第一节 亲和层析基本原理,亲和层析定义,亲和层析是通过生物分子之间,特异可逆结合与解离,的原理，进行生物分子特异分离的层析技术。,在,19681972,年,Anfinsen,创建了亲和层析技术。,20,世纪,70,年代有了惊人的发展，并逐步得到广泛的应用。,目前，已有活化载体及其衍生物产品出售，使得亲和层析变得更简捷。,亲和层析发展过程,亲和层析优点,其他方法利用理化性质的差异，许多分子差异很小，要得到纯度高的单一分子，要联合运用多种方法，最终得率低；,而亲和层析迅速、简单、高效、特异。,第二节 亲和层析操作,载体,配基,一、载体的选择,理想的载体应满足下面的要求：,具有,较好,的物理化学,稳定性,较多的活性基团,能够和,配体稳定的结合,结构为,均匀,的,多孔网状,结构,与样品中的各个组分均,没有明显的非特异性吸附,亲和层析常用的载体,纤维素,葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺凝胶,多孔玻璃珠,目前应用最多的是,Sepharose4B,，,是由,D-,半乳糖和,3,6-,脱水,-L-,半乳糖结合成的链状多糖，基本能符合理想载体的要求。,优点,缺点,纤维素,价格低、活性基团较多,非特异性吸附强、稳定性和均一性较差,葡聚糖,稳定性较好,孔径较小、稳定性不好,聚丙烯酰胺,同上,同上,琼脂糖,非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化,多孔玻璃,机械强度好，化学稳定性好,活性基团较少、对蛋白质有较强的吸附作用,二、配体的选择,可选择的配体有,抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体；,其他物质，如,外源凝集素、,polyA,、,polyU,、染料和金属离子。,配体的分类,特异性配体,只与,单一,或,很少种类,的蛋白质等生物大分子结合的配体,如：,抗原和抗体、酶和它的抑制剂,通用性配体,特异性不是很强，能和,某一类,的蛋白质等生物大分子结合的配体,如：,凝集素可以结合各种糖蛋白,与基质稳定的共价结合,自身应具有较好的稳定性,与待分离的物质有适当的亲和力,与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性,优良的配体须具备的条件,配体,待纯化的蛋白质,配体,待纯化的蛋白质,抗原,特定单克隆抗体或多克隆抗体,肝素,凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、,DNA,聚合酶,单克隆抗体,特定抗原,胆固醇,胆固醇受体、胆固醇结合蛋白,蛋白质,A/,蛋白质,G,免疫球蛋白,脂肪酸,脂肪酸结合蛋白、白蛋白,蛋白酶抑制剂,蛋白酶,核苷酸,核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶,磷酸,磷酸酶,苯基硼酸盐,糖蛋白,三嗪染料,脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素,凝集素,糖蛋白,抗生物素蛋白,含生物素的酶,糖,凝集素、糖苷酶,蛋白质亲和层析中的合适配体,三、亲和吸附剂的制备,溴化氰活化法,环氧乙烷基活化法,指通过对载体进行一定的化学处理，使载体表面上的一些,化学基团,转变为,易于和特定配体结合,的,活性基团,。,1,、载体的活化,溴化氰活化,生成,亚胺碳酸,活性基团，可以和含有伯氨基,(,NH,2,),的配体,反应，生成,异脲衍生物,缺点：,非特异性吸附,，影响亲和层析的分辨率。,与配体,结合不够稳定,溴化氰有,剧毒,、,易挥发,，操作不便。,环氧乙烷基活化,生成含有,环氧乙烷基,的活性基团，可以结合含有伯氨基,(,NH,2,),、羟基,(OH,),和硫醇基,(,SH,),等基团的配体,优点,不引入电荷基团,，与配体形成的,N,C,、,O,C,和,S,C,键都很,稳定,，使用,寿命长,缺点,与配体偶联时需要,碱性条件,，温度为,2040,，对于一些比较敏感的配体可能不适用,以溴化氰偶联法为例，包括步骤：,活化,偶联,配体结合量的计算,1活化基质,在一定量的贮存载体,Sepharose 4B(,即用布氏漏斗抽干的胶)中，加入等量的蒸馏水和2,molL Na,2,C0,3,溶液(,pH 1112)，,混匀。,另将称量的固体,CNBr,(50300mgg,贮存胶)溶于,二甲基甲酰胺,溶液中。随后迅速把此液加到搅拌的,琼脂糖,悬浮液内进行活化，其,pH,值始终维持在1112之间。,接着把冷却的反应液转到,布氏漏斗,中，用1020倍凝胶体积的,冷水,及0.07,molL NaHC0,3,溶液(,pH8.5),洗涤,。,通过活化反应形成的化合物可能有两种：,其一是,具有反应能力,的,亚氨碳酸盐衍生物,；,其二是,无反应能力,的,氨基碳酸盐,。,2偶联,配体,和,基质,充分,偶联,而,形成,固相载体,。,经活化和洗涤过的基质与等体积的0.20.25,molL,碳酸盐缓冲液(含0.5,molL NaCl,和110,pmol,配体,ml,基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2,h(,室温)或过夜(4)，以便,配体和基质,充分偶联,而,形成,固相载体,。,3配体结合量的测定,配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体的量表示的。如用,mg/ml,表示。,测得的配体结合量，可,作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。,具体测定方法有两种，即,直接测定法和间接测定法,。,(1)直接测定法,2，4，6,三硝基苯磺酸钠的颜色试验,根据配体的特性进行测定,(2)间接测定法,推算法,一般情况下，从,加入配体的数量,中,减去,配体与活化琼脂糖偶联后,洗涤出来的配体量,，即可大致推算出配体的结合量,。,根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量,其方法有：,一是把亲和吸附剂,装入柱,(0.5,cm10cm),内，,加入,过量的欲分离,大分子物质,，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底,洗去,非专一性的物质，然后再用特异的,洗脱剂,洗出欲分离的大分子物质。,根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。,二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。,四、特异性吸附,当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；,当样品开始进入柱中时，配体和欲分离的大分子物质间相互触，并形成复合物，当样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。,特异性吸附影响因素,配体与欲分离物质的亲和力,：亲和力大时，吸附量大。,pH,：随,pH,降低，吸附量减少。,离子强度,：在相同,pH,条件下，离子强度降低，吸附量反而增大。,五、分离大分子物质（洗脱）,除去杂质,样品过柱后，可用大量的,平衡液,即起始缓冲液,洗去,无亲和力的,杂蛋白,，有时也可用,不同的缓冲液,洗涤去除；,最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。,洗脱有效成分,将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。,洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力决定。,亲和力较小时,，可连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。,亲和力一般时,，主要改变缓冲液的性质,(,如改变,pH,值或离子强度,),，使复合物之间的亲和力降到足以分离的程度。,亲和力较大时,，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白质变性剂洗脱。,六、亲和层析柱的再生,当洗脱结束后连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。,经过这样处理的柱子可以再次上样，进行第二次亲和层析。,第三节 亲和层析应用,一、纯化大分子物质,1,）抗原、抗体、抗原抗体结合物（以金黄色葡萄球菌蛋白为配体）,2,）糖蛋白 以凝集素为配体,3,）核酸,PolyU-Sepharose,分离,mRNA,PolyA-Sepharose,分离与,mRNA,特异结合的蛋白质,二、研究酶的结构和功能,在进行酶的结构与功能研究时，经常使用,专一的化学试剂改变酶的功能团。这种操作往往会,引起,酶活力,的,不完全丧失,，但是难以确定残留的酶活力是残留的天然酶活力?还是化学试剂作用后酶的催化能力变小了?,这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后，进行活力检测才能确定。,它们之间的分离是比较困难的。,然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。,原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的则与配体有亲和力。以此分离。,例如,实验现象：,葡萄球菌核酸,酶,经亲和,标记物,标记后，发现：,该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，,可导致,酶活力丧失83，剩余酶活力17。,问题：,该实验的现象，,究竟是核酸酶的活性中心,被结合,后,仍有,17的酶活力?,还是因为有少量的核酸酶,未标记,上而,残存,酶活力?,研究思路：,将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。,思考题,1,、什么是亲和层析？其原理是什么？,2,、亲和层析时，优良的配体应具备什么条件？,3,、亲和层析特异性吸附的影响因素有哪些？,4,、亲和层析操作洗脱时，根据亲和力大小的不同，如何选择洗脱液？,