质粒的提取实验（碱法）_28页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验一,质粒的提取,(,碱法),3,学时,实验目的,实验原理,实验仪器、材料与试剂,实验步骤,实验结果及讨论,实验目的,了解碱法提取质粒的原理；,掌握碱法提取质粒的方法。,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型,DNA,分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。,这种方法是根据共价闭合环状质粒,DNA,与线性染色体,DNA,在拓扑学上的差异来分离它们。,结构的三大要素：,多克隆位点,选择标记（耐药性，,LacZ,）,独立的复制单位,种类：,质粒,噬菌体,酵母人工染色体（,YAC）,反转录病毒载体,表达载体等,pBC,SK map,T-,载体,在碱性条件（,pH 12.5）,下，线性染色体,DNA,的双螺旋结构解开而变性，质粒,DNA,的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体,DNA,分子难以复性，而质粒,DNA,分子很快复性，离心时染色体,DNA,与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒,DNA,则留在上清液中。,用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒,DNA。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器,1.,恒温摇床,2.,超净工作台,3.,高压灭菌锅,4.,高速台式离心机,5.,微量取液器,（二）材料,含,pBC,KS,质粒的大肠杆菌,DH 5。,含,重组质粒的大肠杆菌,DH 5。,（三）试剂,1.,LB,液体培养基（,1,L,）,胰蛋白胨,10,g,酵母提取物,5,g,NaCl,10,g,加去离子水至,800,ml,搅拌，使溶质完全溶解，用,NaOH,调节,pH,值至,7.0,，加入去 离子水至总体积为,1,升，高压蒸汽灭菌,20,分钟。,LB,固体培养基（,1,L,）,在上述,LB,液体培养基（,1,L,）,中加入琼脂粉,15,g,。,2.,Solution,50,mmol,/L,葡萄糖,25,mmol,/L,Tris,.,Cl,(pH 8.0),10,mmol,/L,EDTA,(,pH 8.0,)高压灭菌后，,4,保存备用。,3.,Solution,(,现用现配制,),0,.,2,mol/L,NaOH,1%SDS,4.,Solution,（100 ml）,5mol/L,KAc,60 ml,冰醋酸,11.5,ml,水,28.5,ml,配制成的溶液,含,3,mol/L,钾盐、,5,mol/L,醋酸 （,pH 4.8,）。,5.,氨苄青霉素（,Amp,）,用无菌水配制成,100,mg/ml,溶液，置,-20,冰箱保存备用。,6.,胰,RNA,酶,将胰,RNA,酶（,RNA,酶,A）,溶于,10,mmol,/L,Tris,.,Cl,(pH 7.5)、15,mmol,/L,NaCl,中，配成,10,mg/ml,的浓度，于,100,加热,15,分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于,-20,。,7.,氯仿，乙醇,，70%,乙醇,。,实验步骤,质粒的提取,1.,用灭菌的牙签挑取单菌落放入,50,ml LB,液体培养基（含,Amp 0.1,mg/ml,）,中，,37,振荡培养过夜。,2.,将菌液倒入1.5,ml,Eppendorf,管中，,10,000,rpm,离心,1,min，,去掉上清液，重复两次。沉淀悬于,200,L,SolutionI,中,涡旋使充分悬浮。,3.,加入,300,L,SolutionII,，,混,匀（注意动作轻），冰箱3 放置5,min。,4.,加入,300,L,SolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5,min。,5.12,000,rpm，,离心,5,min，,将上清移至,1,个新,Eppendorf,管中，注意所取体积（约600,L）。,6.,加入等体积氯仿（约600,L），,混匀（注意动作轻）。12,000,rpm，4，,离心10,min，,取上清液。,7.,上清液中加入预冷的等体积异丙醇，,-20,沉淀 2030,min。,8.12,000 rpm,离心,15,min。,9.,去上清，沉淀加入,500,L 70%,乙醇洗涤,2,次（12,000,rpm,离心3分钟）。,10.,去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。,11每管中加入25,L,无菌水1,L,RNase,，37,溶解质粒,DNA。,Biospin,质粒,DNA,小量提取试剂盒（,实际用）,操作过程,1.将11.5,ml,过夜培养的细菌菌液加入1.5,ml,离心管中。,2.于10，000,rpm,离心30 秒，并弃去上清液。,如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。,3.加250,l,Resuspension,Buffer，,重悬细菌体沉淀。,重悬后应该没有细菌团块。,4.加250,l,细胞,Lysis,Buffer，,轻柔颠倒46 次。,不要剧烈振动，以防止基因组,DNA,被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。,5.加350,l Neutralization Buffer，,立即轻柔颠倒离心管46 次。,溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。,6.于13,000,rpm,离心10 分钟。,如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。,7.将步骤6 离心后得到的上清液转移到,Spin column,内。于6,000,rpm,离心1 分钟，并弃去接液管内液体。,8.向,Spin column,内加650,l Wash Buffer，,于12，000,g,离心3060 秒，并弃去接液管内液体。,9.重复第8 步一次。,10.再次于12，000,rpm,离心1 分钟，然后将,Spin column,转移到无菌的1.5,ml,离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。,11.向,Spin column,内加20,l Elution Buffer、,去离子水或,TE,溶液，并于室温静置1 分钟。,可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。,12.于12，000,rpm,离心1 分钟，1.5,ml,离心管内溶液中含有质粒,DNA。,13.,提取的质粒,DNA,可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。,实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。,如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。,